一、病原檢查

　?。ㄒ唬┘S便檢查

　　糞便檢查是診斷寄生蟲病常用的方法。要取得準(zhǔn)確的結(jié)果，糞便必須新鮮，送檢時(shí)間一般不宜超過(guò)24小時(shí)。如檢查腸內(nèi)原蟲滋養(yǎng)體，最好立即檢查。盛糞便的容器要干凈，并防止污染與干燥；糞便不可混雜尿液等，以免影響檢查結(jié)果。

　　1.直接涂片法　用以檢查蠕蟲卵、原蟲的包囊和滋養(yǎng)體。方法簡(jiǎn)便，連續(xù)作3次涂片，可提高檢出率。

　　⑴蠕蟲卵檢查：滴一滴生理鹽水于潔凈的載玻片，用棉簽棍或牙簽挑取綠豆大小的糞便塊，在生理鹽水中涂抹均勻；涂片的厚度以透過(guò)涂片約可辨認(rèn)書上的字跡為宜。一般在低倍鏡下檢查，如用高倍鏡觀察，需加蓋片。應(yīng)注意蟲卵與糞便中異物的鑒別。蟲卵都具有一定形狀和大小；卵殼表面光滑整齊，具固有色澤；卵內(nèi)含卵細(xì)胞或幼蟲。

　?、圃x檢查：

　　1）活滋養(yǎng)體檢查：涂片應(yīng)較薄，方法同查蠕蟲卵。氣溫愈接近體溫，滋養(yǎng)體的活動(dòng)愈明顯。必要時(shí)可用保溫臺(tái)保持溫度。

　　2）包囊的碘液染色檢查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理鹽水。如碘液過(guò)多，可用吸水紙從蓋片邊緣吸去過(guò)多的液體。若同時(shí)需檢查活滋養(yǎng)體，可在用生理鹽水涂勻的糞滴附近滴一滴碘液，取少許糞便在碘液中涂勻，再蓋上蓋片（圖21－1）。涂片染色的一半查包囊；末染色的一半查活滋養(yǎng)體。

圖21－1　原蟲包囊碘液染色操作方法

碘液配方：碘化鉀4g，碘2g，蒸餾水100ml.

　　3）隱孢子蟲卵囊染色檢查：目前較佳的方法為金胺酚改良抗酸染色法。對(duì)于新鮮糞便或經(jīng)10％福爾馬林固定保存（4℃1個(gè)月內(nèi)）的含卵囊糞便都可用此法染色。染色過(guò)程是先用金胺－酚染色，再用改良抗酸染色法復(fù)染。方法步驟如下：

　　金胺－酚染色法：

　?、偃疽号渲疲?g／L金胺－酚染色液（第一液）：金胺0.1g，石碳酸5.0g，蒸餾水100ml；3％鹽酸酒精（第二液）：鹽酸3ml，95％酒精100ml；5g／L高錳酸鉀液（第三液）：高錳酸鉀0.5g，蒸餾水100ml.

　?、谌旧襟E：滴加第一液于晾干的糞膜上，10～15分鐘后水洗；滴加第二液，1分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置熒光顯微鏡檢查。

　　低倍熒光鏡下，可見(jiàn)卵囊為一圓形小亮點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)乳白色熒光。高倍鏡下卵囊呈乳白或略帶綠色，卵囊壁為一薄層，多數(shù)卵囊周圍深染，中央淡染，似環(huán)狀，或深染結(jié)構(gòu)偏位，有些卵囊全部為深染。但有些標(biāo)本可出現(xiàn)非特異的熒光顆粒，應(yīng)注意鑒別。

　　改良抗酸染色法：

　?、偃疽号渲疲菏克釓?fù)紅染色液（第一液）：堿性復(fù)紅4g，　 95％酒精20ml，石炭酸8ml，蒸餾水100ml；10％硫酸溶液（第二液）：純硫酸10ml，蒸餾水90ml（邊攪拌邊將硫酸徐徐傾入水中；20g／L孔雀綠液（第三液）：20g／L孔雀綠原液1ml，蒸餾水10ml.

　?、谌旧襟E：滴加第一液于糞膜上，1.5～10分鐘后水洗；滴加第二液，1～10分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置顯微鏡下觀察。

　　經(jīng)染色后，卵囊為玫瑰紅色，子孢子呈月牙形，共4個(gè)。其他非特異顆粒則染成藍(lán)黑色，容易與卵囊區(qū)分。

　　不具備熒光鏡的實(shí)驗(yàn)室，亦可用上述方法先后染色，然后在光鏡低、高倍下過(guò)篩檢查，發(fā)現(xiàn)小紅點(diǎn)再用油鏡觀察。效果好，可提高檢出速度和準(zhǔn)確性。

　　2.厚涂片透明法（改良加藤法）取約5mg（已用100目不銹鋼篩除去糞渣）糞便，置于載玻片上，覆以浸透甘油－孔雀綠溶液的玻璃紙片，輕壓，使糞便鋪開（20×25mm）。置于30～36℃溫箱中約半小時(shí)或25℃約1小時(shí)。待糞膜稍干，即可鏡檢。

　　玻璃紙準(zhǔn)備：將玻璃紙剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油－孔雀綠溶液（含純甘油100ml、水100ml和3％孔雀綠1ml的水溶液）中，至少浸泡24小時(shí)，至玻璃紙呈現(xiàn)綠色。

　　使用此法需掌握糞膜的合適厚度和透明的時(shí)間。如糞膜厚，透明時(shí)間短，蟲卵難以發(fā)現(xiàn)；如透明時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則蟲卵變形，也不易辨認(rèn)。

　　3.濃聚法

　　⑴沉淀法：原蟲包囊和蠕蟲卵的比重大可沉集于水底，有助于提高檢出率。但比重較小的鉤蟲卵和某些原蟲包囊則效果較差。

　　1）重力沉淀法：取糞便20～30g、加水成混懸液，經(jīng)金屬篩（40～60孔）或2、3層濕紗布過(guò)濾，再加清水沖洗殘?jiān)?；過(guò)濾糞液在容器中靜置25分鐘，倒去上液，重新加滿清水，以后每隔15～20分鐘換水一次（3～4次），直至上液清晰為止。最后倒去上液，取沉渣作涂片鏡檢。如檢查包囊，換水間隔時(shí)間宜延長(zhǎng)至約6小時(shí)換一次（圖21－2）。

圖21－2　糞便沉淀及毛蚴孵化法

　　2）離心沉淀法：將上述濾去粗渣的糞液離心（1500～2000rpm/min）1～2分鐘，倒去上液，注入清水，再離心沉淀，如此反復(fù)沉淀3～4次，直至上液澄清為止，最后倒去上液，取沉渣鏡檢。

　　3）汞碘醛離心（MIFC）沉淀法：糞便1g，加適量（約10ml）汞碘醛液，充分調(diào)勻，用2層脫脂紗布過(guò)濾，再加入乙醚4ml，搖2分鐘，離心（2000rpm/min）1～2分鐘，即分成乙醚、糞渣、汞碘醛及沉淀物4層。吸棄上面3層，取沉渣鏡檢。

　　汞碘醛配制：

　?、俟∕F）液：1／1000硫柳汞酊200ml，甲醛（40％）25ml，甘油50ml，蒸餾水200ml.②盧戈氏液：碘5g，碘化鉀10g，蒸餾水100ml.

　　檢查時(shí)取汞醛液2.35ml及5％盧戈氏液0.15ml混合備用。但混合液在8小時(shí)后即變質(zhì)，不應(yīng)再用；碘液亦不這且于1周后再用。

　　4）醛醚沉淀法：置糞便1～2g于小容器內(nèi)，加水10～20ml調(diào)勻，將糞便混懸液經(jīng)2層紗布（或100目金屬篩網(wǎng)）過(guò)濾，離心（2000rpm/min）2分鐘；倒去上層糞液，保留沉渣，加水10ml混勻，離心2分鐘；倒去上液，加10％甲醛7ml.5分鐘后加乙醚3ml，塞緊管口并充分搖勻，取下管口塞，離心2分鐘，即可見(jiàn)管內(nèi)自下而上分為4層。取管底沉渣涂片鏡檢。如檢查原蟲包囊，可加盧戈氏液染色，加蓋片鏡檢。

　　⑵浮聚法：利用比重較大的液體，使原蟲包囊或蠕蟲卵上浮，集中于液體表面。常用的方法有兩種：

　　1）飽和鹽水浮聚法：此法用以檢查鉤蟲卵效果最好。用竹簽取黃豆粒大小的糞便置于浮聚瓶（高3.5cm，直徑約2cm的圓形直筒瓶）中，加入少量飽和鹽水調(diào)勻，再慢慢加入飽和鹽水到液面略高于瓶口，但不溢出為止。此時(shí)在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15分鐘后，將載玻片提起并迅速翻轉(zhuǎn)，鏡檢（圖21－3）。

圖21－3　飽和鹽水浮聚法

　　飽和鹽水配制：將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內(nèi)，不斷攪動(dòng)，直至食鹽不再溶解為止。

　　2）硫酸鋅離心浮聚法：此法可用于檢查原蟲包囊，球蟲卵囊和蠕蟲卵。取糞便約1g，加10～15倍的水，充分?jǐn)囁?，按離心沉淀法過(guò)濾，反復(fù)離心3～4次，至水清為止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸鋅液（33％的溶液），調(diào)勻后再加硫酸鋅溶液至距管口約1cm處，離心1分鐘。用金屬環(huán)取表面的糞液置于載玻片上，加碘液一滴，鏡檢。

　　3）蔗糖離心浮聚法：此法適用于檢查糞便中隱孢子蟲的卵囊。取糞便約5g，加水15～20ml，以260目尼龍袋或4層紗布過(guò)濾。取濾液離心5～10分鐘，吸棄上清液，加蔗糖溶液（蔗糖500g，蒸餾水320ml，石炭酸6.5ml）再離心，然后如同飽和鹽水浮聚法，取其表液膜鏡檢（高倍或油鏡）。卵囊透明無(wú)色，囊壁光滑，內(nèi)有一小暗點(diǎn)和發(fā)出淡黃色的子孢子。隱孢子蟲的卵囊在漂浮液中浮力較大，常緊貼于蓋片之下，但1小時(shí)后卵囊脫水變形不易辨認(rèn)，故應(yīng)立即鏡檢。也可用飽和硫酸鋅溶液或飽和鹽水替代蔗糖溶液。

　　常見(jiàn)蠕蟲卵、包囊的比重如表21－1。

表21－1　蠕蟲卵及包囊的比重

蟲卵或包囊	比重
華支睪吸蟲卵	1.170～1.190
姜片吸蟲卵	1.190
肝片形吸蟲卵	1.200
日本血吸蟲卵	1.200
帶絳蟲卵	1.140
微小膜殼絳蟲卵	1.050
鉤蟲卵	1.055～1.080
鞭蟲卵	1.150
蟯蟲卵	1.105～1.115
受精蛔蟲卵	1.110～1.130
未受精蛔蟲卵	1.210～1.230
毛圓線蟲卵	1.115～1.130
溶組織內(nèi)阿米巴包囊	1.060～1.070
結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊	1.070
微小內(nèi)蜒阿米巴包囊	1.065～1.070
藍(lán)氏賈第鞭毛蟲包囊	1.040～1.060

　　4.毛蚴孵化法　依據(jù)血吸蟲卵內(nèi)的毛蚴在適宜溫度的清水中，短時(shí)間內(nèi)可孵出的特性而設(shè)計(jì)的方法，適用于星期血吸蟲病患者的糞便檢查。取糞便約30g，先經(jīng)重力沉淀法濃集處理，將糞便沉渣倒入三角燒瓶?jī)?nèi)，加清水（城市中需用去氯水）至瓶口，在20～30℃的條件下經(jīng)4～6小時(shí)后肉眼或放大鏡觀察結(jié)果。如見(jiàn)水面下有白色點(diǎn)狀物作直線來(lái)往游動(dòng)，即是毛蚴。必要時(shí)也可用吸管將毛蚴吸出鏡檢。如無(wú)毛蚴，每隔4～6小時(shí)（24小時(shí)內(nèi)）觀察一次。氣溫高時(shí)，毛蚴可在短時(shí)間內(nèi)孵出，因此在夏季要用1.2％食鹽水或冰水沖洗糞便，最后一次才改用室溫清水（圖21－2）。

　　毛蚴促孵法：將沉淀法處理后的糞便沉渣置于三角瓶?jī)?nèi)，不加水，或?qū)⒓S渣置于吸水紙上，再放在20～30℃溫箱中過(guò)液。檢查時(shí)，加清水，2小時(shí)后就可見(jiàn)到孵出的毛蚴。此法毛蚴孵出時(shí)間較一致，數(shù)量也較多。

　　5.肛門拭子檢查法　適用于在肛周產(chǎn)卵（蟯蟲），或常在肛門附近發(fā)現(xiàn)蟲卵（帶絳蟲）的蟲卵檢查法。

　?、琶藓炇米臃ǎ合葘⒚藓灲菰谏睇}水中，取出時(shí)擠去過(guò)多的鹽水，在肛門周圍擦拭，隨后將棉簽放入盛有飽和鹽水的試管中，用力攪動(dòng)，迅速提起棉簽，在試管內(nèi)壁擠干鹽水后充去，再加飽和鹽水至管口處，覆蓋一載玻片，務(wù)使其接觸液面，5分鐘后取載玻片鏡檢。也可將擦拭肛周的棉簽放在盛清水的試管中，經(jīng)充分浸泡，取出，在試管內(nèi)壁擠去水分后棄去。試管靜置10分鐘，或經(jīng)離心后，倒去上液，取沉渣鏡檢。

　　⑵透明膠紙法：用長(zhǎng)約6cm，寬約2cm的透明膠紙粘擦肛門周圍的皮膚，取下膠紙，將有膠面平貼玻片上，鏡檢。

　　6.試管濾紙培養(yǎng)法　也稱鉤蚴培養(yǎng)法。根據(jù)鉤蟲卵在適宜條件下可在短時(shí)間內(nèi)孵出幼蟲的原理設(shè)計(jì)的方法。如冷開水約1ml于潔凈試管內(nèi)（1×10cm），將濾紙剪成與試管等寬但較試管稍長(zhǎng)的T字型紙條，用鉛筆書寫受檢者姓名或編號(hào)于橫條部分。取糞便約0.2～0.4g，均勻地涂抹在緊豎條紙條的上部2／3處，再將紙條插入試管，下端浸泡在水中，以糞便不接觸水面為度。在20～30℃條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每天沿管壁補(bǔ)充冷開水，以保持水面位置。3天后肉眼或放大鏡檢查試管底部。鉤蚴在水中常作蛇形游動(dòng)，蟲體透明。如未發(fā)現(xiàn)鉤蚴，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)觀察至第5天。氣溫太低時(shí)可將培養(yǎng)管放入溫水（30℃左右）中數(shù)分鐘后，再行檢查（圖21－4）。

圖21－4　鉤蚴培養(yǎng)法

　　此法亦可用于分離人體腸道內(nèi)各種阿米巴滋養(yǎng)體及人毛滴蟲滋養(yǎng)體，且能提高檢出率。但是，每管糞便量應(yīng)為1.0g；適宜溫度為25～30℃；培養(yǎng)時(shí)間為2～4天。臨床上為了及時(shí)報(bào)告致病原蟲，可于培養(yǎng)48小時(shí)后鏡檢。檢查腸道各種原蟲，仍應(yīng)結(jié)合碘液涂片法以檢出原蟲包囊。

　　7.蟲卵計(jì)數(shù)法　蟲卵計(jì)數(shù)用于估計(jì)人體內(nèi)寄生蟲的感染度，常用司徒爾（Stoll）氏法，即司氏稀釋蟲卵計(jì)數(shù)法（圖21－5）。

圖21－5　　司氏蟲卵計(jì)數(shù)法

圖21－6　 定量板

　　用特制的三角燒瓶（或普通三角燒瓶），容量為65ml左右，在燒瓶的頸部相當(dāng)于56和60ml處有兩個(gè)刻度。先把0.1mol/l NaOH溶液倒入瓶?jī)?nèi)至56ml處，再慢慢地加入糞便，到液面上升到60ml處，然后放進(jìn)玻璃珠10余顆，用橡膠塞塞緊瓶口，充分搖動(dòng)，使其成為十分均勻的混懸液。

　　計(jì)數(shù)時(shí)充分搖勻，用有刻度的小吸管取0.075或0.15ml糞液置于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下計(jì)算全片的蟲卵數(shù)。乘以200（吸0.075ml）或100（吸0.15ml）即得每克為糞便蟲卵數(shù)。由于糞便的性狀明顯地影響估算結(jié)果，因此不成形的糞便的蟲卵數(shù)應(yīng)再乘糞便性狀系數(shù)，即半成形糞便×1.5，軟濕形糞便×2，粥狀糞便×3，水瀉形糞便×4。

　　8.定量透明法　適用于各種糞便內(nèi)蠕蟲卵的檢查及計(jì)數(shù)。此法系應(yīng)用改良聚苯乙烯作定量板（圖21－6），大小為40×30×1.37mm，?？诪橐婚L(zhǎng)圓孔，大小為8×4mm，兩端呈半圓形，所取的糞樣平均為41.7mg.操作時(shí)將大小約4×4cm的100目尼龍網(wǎng)或金屬篩網(wǎng)覆蓋在糞便標(biāo)本上，自篩網(wǎng)上用刮片刮取糞便，置定量板于載玻片上，用一手的兩指壓住定量板的兩端，將刮片上的糞便填滿?？?，刮去多余糞便。掀起定量板，載玻片上留下一個(gè)長(zhǎng)形糞樣，然后在糞條上覆蓋含甘油－孔雀綠溶液的大小約為5.0～2.6cm的玻璃紙條，展平后加壓，使玻璃紙下的糞便鋪成長(zhǎng)橢圓形。經(jīng)1～2小時(shí)糞便透明后置鏡下計(jì)數(shù)。將所得蟲卵數(shù)×24，再乘上述糞便性狀系數(shù)，即為每克糞便蟲卵數(shù)（eggs 　per　gram，EPG）。常見(jiàn)蠕蟲的每條雌蟲每天排卵數(shù)如表21－2.

表21－2　各種蠕蟲每條雌蟲每日排卵數(shù)

蟲 名	產(chǎn)卵數(shù)／日／條（平均數(shù)）
華支睪吸蟲	1600～4000（2400）
姜片蟲	15000～48000（25000）
衛(wèi)氏并殖吸蟲	10000～20000
日本血吸蟲	1000～3500
豬帶絳蟲	30000～50000／孕節(jié)
牛帶絳蟲	97000～124000／孕節(jié)
十二指腸鉤蟲	10000～30000（24000）
美洲鉤蟲	5000～10000（9000）
蛔蟲	234000～245000（240000）
鞭蟲	1000～7000（2000）

　　9.淘蟲檢查法　為考核驅(qū)蟲療效，常需從糞便中淘取蠕蟲進(jìn)行鑒定與計(jì)數(shù)。取患者服藥后24～72小時(shí)的全部糞便，加水?dāng)嚢瑁煤Y（40目）或紗布濾出糞渣，經(jīng)水反復(fù)沖洗后，倒在盛有清水的大型玻皿內(nèi)。檢查混雜在糞渣中的蟲體時(shí)，應(yīng)在玻皿下襯以黑紙。

　　10.帶絳蟲孕節(jié)檢查法　絳蟲節(jié)片用清水洗凈，置于兩載玻片之間，輕輕壓平，對(duì)光觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并根據(jù)子宮分支情況鑒定蟲種。也可用注射器從孕節(jié)后端正中部插入子宮內(nèi)徐徐注射炭素墨汁或卡紅，待子宮分支顯現(xiàn)后計(jì)數(shù)。

　　卡紅染液配制：鉀明礬飽和液100ml，卡紅3g，冰醛酸10ml.混合液置于37℃溫箱內(nèi)過(guò)夜，過(guò)濾后即可應(yīng)用。

　?。ǘ┭簷z查

　　血液檢查是診斷瘧疾、絲蟲病的基本方法。涂制血膜用的載玻片用前需經(jīng)洗滌液處理，自來(lái)水、蒸餾水沖洗，在95％酒精中浸泡，擦干或烤干后使用。

　　洗滌液配制：常用玻璃器皿的洗滌液為鉻酸洗液，含工業(yè)濃硫酸100ml，重鉻酸鉀80g，水1000ml.先用冷水將重鉻酸鉀溶化，然后徐徐加入濃硫酸，同時(shí)用玻璃棒攪拌。

　　1.檢查瘧原蟲

　　⑴取血與涂片：用75％酒精棉球消毒耳垂，待干后用左手拇指與食指捏著耳垂下方，并使耳垂下側(cè)方皮膚繃緊，右手持取血針、刺破皮膚，擠出血滴。薄、厚血膜可涂制在同一張玻片上（圖21－7）。

圖21－7　薄厚血膜制作步驟

　　1）薄血膜制片：在載玻片1／3與2／3交界處蘸血一小滴，以一端緣光滑的載片為推片，將推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端緣擴(kuò)散后，自右向左推成薄血膜。操作時(shí)兩載片間的角度為30～45℃，推動(dòng)速度適宜。理想的薄血膜，應(yīng)是一層均勻分布的血細(xì)胞，血細(xì)胞間無(wú)空隙且涂血膜末端呈掃帚狀。

　　2）厚血膜制片：載玻片的另一端（右）1／3處蘸血一小滴（約10mm3），以推片的一角，將血滴自內(nèi)向外作螺旋形攤開，使之成為直徑約0.8～1cm，厚薄均勻的厚血膜。厚血膜為多層血細(xì)胞的重疊，約等于20倍薄血膜的厚度。

　　⑵固定與染色：血片必須充分晾干，否則染色時(shí)容易脫落。固定時(shí)用小玻棒蘸甲醇或無(wú)水酒精在薄血膜上輕輕抹過(guò)。如薄、厚血膜在同一玻片上，須注意切勿將固定液帶到厚血膜上，因厚血膜固定之前必須先進(jìn)行溶血?？捎玫喂艿嗡诤裱ど?，待血膜呈灰白色時(shí)，將水倒去，晾干。在稀釋各種染液和沖洗血膜時(shí)，如用緩沖液則染色效果更佳。緩沖液的配制如下：

　　磷酸氫二鈉液：磷酸氫二鈉（Na2HPO4）無(wú)水0.464g或Na2HPO4. 2H2O 11.867g或Na2HPO4 . 7H2O17.872g或Na2HPO4. 2H2O23.877g，蒸餾水1000ml.

　　M／15磷酸二氫鉀液：磷酸二氫鉀（Na2HPO4）9.073g，蒸餾水1000ml.

　　使用時(shí)將上述原液按下頁(yè)表配成不同的pH緩沖液：

pH	M／15KH2PO4（ml）	M／15Na2HPO4（ml）	蒸餾水（ml）
6.8	4.9	5.1	90
7.0	6.3	3.7	90
7.2	7.3	2.7	90

　　染色時(shí)臨時(shí)配成pH7.0或7.2的緩沖液。

　　常用的染色劑有姬氏染劑（Giemsa‘s　stain）、瑞氏染劑（Wright’s 　stain）。

　　1）Giemsa染色法：此法染色效果良好，血膜褪色較慢，保存時(shí)間較久，但染色需時(shí)較長(zhǎng)。

　　染液配制：姬氏染劑粉1g，甲醇50ml，純甘油50ml.將姬氏染粉置于研缽中（最好用瑪瑙研缽），加小量甘油充分研磨，加甘油再磨，直至50ml甘油加完為止，倒入棕色玻瓶中。然后分幾次用少量甲醇沖洗缽中的甘油染粉，倒入玻瓶，直至50ml甲醇用完為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置65℃溫箱內(nèi)24小時(shí)或室溫內(nèi)一周過(guò)濾。

　　染色方法：用pH7.0～7.2的緩沖液，將姬氏液稀釋；比例約為15～20份緩沖液加1份姬氏染液。用蠟筆劃出染色范圍，將稀釋的姬氏染液滴于已固定的薄、厚血膜上，染色半小時(shí)（室溫），再用上述緩沖液沖洗。血片晾干后鏡檢。

　　2）快速姬色染色法：姬氏染液1ml，加緩沖液5ml，如前法染色5分鐘后用緩沖液沖洗，晾干后鏡檢。

　　3）Wright染色法：此法操作簡(jiǎn)便，適用于臨床診斷，但甲醇蒸發(fā)甚快，掌握不當(dāng)時(shí)易在血片上發(fā)生染液沉淀，并較易褪色，保存時(shí)間不長(zhǎng)。多用于臨時(shí)性檢驗(yàn)。

　　染液配制：瑞氏染劑粉0.1～0.5g，甲醇97ml，甘油3ml.將瑞氏染劑加入甘油中充分研磨，然后加入少量甲醇，研磨后倒入瓶?jī)?nèi)，再分幾次用甲醇沖洗研缽中的甘油溶液，倒入瓶?jī)?nèi)，直至用完為止，搖勻，24小時(shí)后過(guò)濾待用。一般1、2周后再過(guò)濾。

　　染色方法：瑞氏染液含甲醇，薄血膜不需先固定；而厚血膜則需先經(jīng)溶血，待血膜干后才能染色。染色前先將溶過(guò)血的厚血膜和薄血膜一起用蠟筆劃好染色范圍，以防滴加染液時(shí)四溢。滴染液使覆蓋全部厚、薄血膜上，30秒至1分鐘后用滴管加等量的蒸餾水，輕輕搖動(dòng)載玻片，使蒸餾水和染液混合均勻，此時(shí)出現(xiàn)一層燦銅色浮膜（染色），3～5分鐘后用水緩慢地從玻片一端沖洗（注意勿先倒去染液或直對(duì)血膜沖洗），晾干后鏡檢。

　　2.檢查微絲蚴

　?、判迈r血片檢查：晚間9時(shí)至次晨2時(shí)取血1滴滴于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)蛇形游動(dòng)的幼蟲后，仍須作染色檢查，以確定蟲種。

　?、坪裱z查：厚血膜的制作、溶血、固定與姬氏液染色同瘧原蟲。但需取血3滴，也可用Delafieid蘇木素染色法染色。該染液的配制方法如下：

　　蘇木素1g溶于純酒精或95％酒精10ml中，加飽和硫酸鋁銨（8％～10％）100ml，倒入棕色瓶中，瓶口用兩層紗布扎緊，在陽(yáng)光下氧化2～4周，過(guò)濾，加甘油25ml和甲醇25ml，用時(shí)稀釋10倍左右。

　　已溶血、固定的厚血膜在德氏蘇木素液內(nèi)染10～15分鐘，在1％酸酒精中分色1～2分鐘，蒸餾水洗滌1～5分鐘，至血膜呈藍(lán)色，再用1％伊紅染色0.5～1分鐘，以水洗滌2～5分鐘，晾干后鏡檢。

　　⑶活微絲蚴濃集法：在離心管內(nèi)裝蒸餾水半管，加血液10～12滴，再加生理鹽水混勻，離心沉淀3分鐘，取沉渣檢查?；蛉§o脈血1ml，置于盛有3.8％枸櫞酸鈉0.1ml的試管中，搖勻，加水9ml，俟紅細(xì)胞溶化后，離心（3000rpm/min）2分鐘，倒去上液，加水再離心，取沉渣鏡檢。

　　（三）排泄物與分泌物等的檢查

　　1.痰液　痰中可能查見(jiàn)肺吸蟲卵、溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體、棘球蚴的原頭蚴、糞類圓線蟲幼蟲、蛔蚴、鉤蚴、塵螨等；卡氏肺孢子蟲的包囊也可出現(xiàn)于痰中，但檢出率很低。

　?、欧挝x卵檢查：可先用直接涂片法檢查，如為陰性，改用濃集法集卵，以提高檢出率。

　　直接涂片法：在潔凈載玻片上先加1～2滴生理鹽水，挑取痰液少許，最好選帶鐵銹色的痰，涂成痰膜，加蓋片鏡檢。如未發(fā)現(xiàn)肺吸蟲卵，但見(jiàn)有夏科－雷登晶體，提示可能是肺吸蟲患者，多次涂片檢查為陰性者，可改用濃集法。

　　濃集法：收集24小時(shí)痰液，置于玻璃杯中，加入等量10％NaOH溶液，用玻棒攪勻后，放入37℃溫箱內(nèi)，數(shù)后痰液消化成稀液狀。分裝于數(shù)個(gè)離心管內(nèi)，以1500rpm/min離心5～10分鐘，充去上清液，取沉渣滴涂片檢查。

　　⑵溶組織內(nèi)阿米巴大滋養(yǎng)體檢查：取新鮮痰液作涂片。天冷時(shí)應(yīng)注意鏡臺(tái)載玻片保溫。高倍鏡觀察。如為阿米巴滋養(yǎng)體，可見(jiàn)其伸出偽足并作定向運(yùn)動(dòng)。

　?、巧鲜銎渌娜湎x幼蟲及螨類等宜用濃集法檢查。

　　2.十二指腸液和膽汁　用十二指腸引流管抽取十二指腸液及膽汁，以直接涂片法鏡檢；也可經(jīng)離心濃集后，吸取沉渣鏡檢?？蓹z查藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體、華支睪吸蟲卵、肝片形吸血卵和布氏姜片蟲卵等；急性阿米巴肝膿腫患者偶在膽汁中發(fā)現(xiàn)大滋養(yǎng)體。

　　檢查方法：可將各部分十二指腸引流液滴于載玻片上，加蓋片后直接鏡檢。為提高寄生蟲檢出率，常將各部分引流加生理鹽水稀釋攪抖后，分裝離心管，以2000rpm/min，離心5～10分鐘，吸取沉渣涂片鏡檢。如引流液過(guò)于粘稠，應(yīng)先加10％NaOH消化后再離心。引流中的賈第蟲滋養(yǎng)體常附著在粘液小塊上，或蟲體聚集成絮片狀物。肝片形吸蟲卵與姜片蟲卵不易鑒別，但前者可出現(xiàn)于膽汁；而后者只見(jiàn)于十二指腸液中。

　　3.尿　一般先離心，后取沉渣鏡檢。但乳糜尿需加等量乙醚，用力振蕩，使脂肪溶于乙醚。然后吸去脂肪層，離心，取沉渣鏡檢。

　　4.鞘膜積液　主要檢查班氏微絲蚴。陰囊皮膚經(jīng)碘酒精消毒后，用注射器抽取鞘膜積液作直接涂片檢查，也可加適量生理鹽水稀釋離心，取沉渣鏡檢。

　　5.陰道分泌物　檢查陰道毛滴蟲。

　　直接涂片法：用消毒棉簽在受檢查者陰道后穹窿、子宮頸及陰道壁上取分泌物，然后在有1～2滴生理鹽水的載玻片上作涂片鏡檢，可發(fā)現(xiàn)活動(dòng)的蟲體。天氣寒冷時(shí)，應(yīng)注意保溫。

　　懸滴法：取陰道分泌物置于周緣涂抹一薄層凡士林蓋片上的生理鹽水中，翻轉(zhuǎn)蓋片小心覆蓋在具凹孔的載玻片上，稍加壓使兩片粘合，液滴懸于蓋片下面，鏡檢。

　　（四）其它器官組織檢查

　　1.骨髓穿刺　主要檢查杜氏利什曼原蟲無(wú)鞭毛體。一般常作髂骨穿刺，患者側(cè)臥，露出髂骨部位。視年齡大小，選用17～20號(hào)帶有針芯的干燥無(wú)菌穿刺針，從髂骨前上刺后約1cm處刺入皮下，當(dāng)針尖觸及骨面時(shí)，再慢慢地鉆入骨內(nèi)約0.5～1.0cm，即可拔出針芯，接上2ml的干燥注射器，抽取骨髓液。取少許骨髓液作涂片；甲醇固定，同薄血膜染色法染色，油鏡檢。

　　2.淋巴結(jié)穿刺

　?、爬猜x：檢出率低于骨髓穿刺，但方法簡(jiǎn)便、安全，且患者經(jīng)治療后，淋巴結(jié)內(nèi)原蟲消失較慢，故仍有一定價(jià)值。一般選腹股溝部，先將局部皮膚消毒，用左手拇指和食指捏住一個(gè)較大的淋結(jié)，右手取干燥無(wú)菌的6號(hào)針頭刺入淋巴結(jié)，此時(shí)淋巴結(jié)組織液自能進(jìn)入針內(nèi)。稍待片刻，拔出針頭，將針頭內(nèi)少量的淋巴結(jié)組織液注于載玻片上，作涂片染色檢查。也可用摘除的淋巴結(jié)的切面做涂片，染色后鏡檢。

　?、平z蟲成蟲：可用注射器從可疑的淋巴結(jié)節(jié)中抽取成蟲，或剖檢摘除的結(jié)節(jié)尋找成蟲，也可作病理組織切片檢查。

　　3.肌肉活檢

　?、判x幼蟲：用外科手術(shù)從患者的腓腸肌或肱或股二頭肌取米粒大小的肌肉一塊，置于載玻片上，加50％甘油滴，蓋上另一載玻片，均勻用力壓緊，低倍鏡下觀察。取下肌肉須立即檢查，否則幼蟲變得模糊，不易檢查。

　　⑵豬囊尾蚴：摘取肌肉內(nèi)的結(jié)節(jié)，剝除外層纖維被膜，在2張載玻片間壓平、鏡檢。也可經(jīng)組織固定后作切片染色檢查。

　　4.皮膚　檢查疥螨，蠕形螨，利什曼原蟲等。

　?、沤牝簠⒖础敖牝徒戬彙保∫还?jié)。

　?、迫湫悟簠⒖础叭湫悟腿湫悟　币还?jié)。

　?、抢猜x：在皮膚上出現(xiàn)丘疹和結(jié)節(jié)等疑似皮膚型黑熱病患者，可選擇皮損較明顯之處，作局部消毒，用干燥滅菌的注射器，刺破皮損處，抽取組織液作涂片；或用消毒的鋒利小剪，從皮損表面剪取一小片皮膚組織，以切面作涂片；也可用無(wú)菌解剖刀切一小口，刮取皮膚組織作涂片。以上涂片均用瑞氏或姬氏染液染色。如涂片未見(jiàn)原蟲，可割取小丘疹或結(jié)節(jié)，固定后，作組織切片染色檢查。

　　5.直腸粘膜　用直腸鏡從直腸粘膜病變組織內(nèi)可查見(jiàn)日本血吸蟲卵及溶組織阿米巴滋養(yǎng)體。

　　日本血吸蟲卵：用直腸鏡自直腸取米粒大小的粘膜一塊，經(jīng)水洗后，放在2載玻片間，輕輕壓平，鏡檢。蟲卵鑒別見(jiàn)表21.－3.

　　表21－3　粘膜內(nèi)血吸蟲卵未染色之鑒別

　　活卵 近期變性卵 死卵（鈣化卵）

　　顏色 淡黃至黃褐色 灰白至略黃色 灰褐色至棕紅卵殼 較薄 薄或不均勻 厚而不均勻胚膜 清楚 清楚 不清楚內(nèi)含物 卵黃細(xì)胞或胚團(tuán)或毛蚴 淺灰色或黑色小點(diǎn)或折光均勻的顆?；蛭s的毛蚴 兩極可有密集的黑點(diǎn)含網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或塊狀物

　　溶組織阿米巴：用乙狀結(jié)腸鏡觀察潰瘍形狀，自潰瘍邊緣或深層刮取潰瘍組織，置于載玻片上，加少量生理鹽水，蓋上蓋片，輕輕壓平，立即鏡檢。也可取出一小塊病變的粘膜組織，固定切片，染色檢查。

　　6.肺組織　檢查卡氏肺孢子蟲包囊。取一小塊肺組織作涂片，自然干燥后甲醇固定，用改良銀染色法進(jìn)行染色。

　　改良銀染色法染色步驟：

　　1.將肺涂片置于5％鉻酸，氧化15分鐘，溫度為20℃。氧化后的標(biāo)本均從流水沖洗數(shù)秒。

　　2.1％亞硫酸氫鈉經(jīng)1分鐘，自來(lái)水沖洗后，蒸餾水洗滌3～4次。

　　3.放入四胺銀工作液內(nèi)，并在60℃孵育約90分鐘，至標(biāo)本轉(zhuǎn)至黃褐色為止。流水、蒸餾水各洗5分鐘。

　　4.0.1％氯化金2～5分鐘，蒸餾水洗4～5次。

　　5.2％硫代硫酸鈉5分鐘，流水至少洗10分鐘。

　　6.亮緣復(fù)染45秒。

　　7.95％，99％，100％乙醇逐級(jí)脫水。

　　8.二甲苯透明3次，樹膠封片。

　　染色結(jié)果顯示，卡氏肺孢子蟲包囊呈圓形、卵圓形或不規(guī)則的多角形，囊壁為淡褐色或深褐色。紅細(xì)胞為淡黃色，其余背景呈淡綠色。

　?。惻寤?姜洪杰）

　　二、免疫論斷及新技術(shù)應(yīng)用

　?。ㄒ唬┢?nèi)試驗(yàn)

　　利用宿主的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，將特異抗原液注入皮內(nèi)，觀測(cè)皮丘及紅暈反應(yīng)以判斷有無(wú)特異抗體（IgE）的存在稱皮內(nèi)試驗(yàn)（intradermal 　test，IDT）。

　　皮內(nèi)試驗(yàn)用于多種寄生蟲病的檢測(cè)，如血吸蟲病、肺吸蟲病等。最常用于血吸蟲病的調(diào)查，操作簡(jiǎn)單，并且可即時(shí)觀察結(jié)果，適宜現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。大多用粗制可溶性血吸蟲蟲卵抗原（稀釋度為1：4000）或成蟲冷浸抗原（稀釋度為1：8000）敏感性高，其陽(yáng)性率在93％～97％，但有部分假陽(yáng)性反應(yīng)（2.1％～3.5％），并且對(duì)其他寄生蟲病交叉反應(yīng)較高。皮內(nèi)試驗(yàn)可用作①過(guò)篩方法，先作皮試，陽(yáng)性者再作進(jìn)一步追查；②臨床輔助診斷；③考核預(yù)防效果，用作檢查新感染的方法，特別對(duì)兒童。

　?。ǘ┤旧囼?yàn)

　　染色試驗(yàn)（dye　test，DT）是比較獨(dú)特的免疫反應(yīng)，是目前診斷弓形蟲病較好的方法，已廣泛用于該病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

　　新鮮弓形蟲滋養(yǎng)體和正常血清混合，在37℃作用1小時(shí)或室溫?cái)?shù)小時(shí)后，大部分弓形蟲失去原來(lái)的新月形，而變?yōu)閳A形或橢圓形，用堿性美藍(lán)染色時(shí)著色很深。但新鮮弓形蟲和免疫血清混合時(shí)，蟲體仍保持原有形態(tài)，用堿性美藍(lán)染色時(shí)，著色很淺或不著色。其原因可能是由于弓形蟲受到特異體抗體和輔助因子協(xié)同作用后，蟲體細(xì)胞變性，結(jié)果蟲體對(duì)堿性美藍(lán)不易著色。

　　材料和試劑以弓形蟲速殖子為抗原；采用正常人血清為致活因子。堿性美藍(lán)溶液，取美藍(lán)10g加入95％酒精100ml，制成飽和酒精溶液，過(guò)濾后取3ml加pH11，要求臨用時(shí)新鮮配制。待檢血清經(jīng)56℃30分鐘滅活，冰箱保存?zhèn)溆谩?/P>

　　方法將待檢血清用生理鹽水倍比稀釋，每孔0.1ml，加上述稀釋的弓形蟲速殖子0.1ml，置37℃水浴1小時(shí)，加堿性美藍(lán)溶液0.02ml／孔，37℃水浴15分鐘，以每孔聚懸液1滴于載玻片上，加蓋玻片，高倍顯微鏡檢查，計(jì)數(shù)100個(gè)弓形蟲速殖子，統(tǒng)計(jì)著色和不著色速殖子比例數(shù)。

　　結(jié)果判定以能使50％弓形蟲不著色的血清最高稀釋度為該血清染色試驗(yàn)陽(yáng)性效價(jià)。陽(yáng)性血清稀釋度1：8為隱性感染；1：256為活動(dòng)性感染；1：1024為急性感染。

　?。ㄈ┉h(huán)卵沉淀試驗(yàn)

　　環(huán)卵沉淀試驗(yàn)（circumoval　precipitin　test，COPT）是以血吸蟲整卵為抗原的特異免疫血清學(xué)試驗(yàn)，卵內(nèi)毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物質(zhì)經(jīng)卵殼微孔滲出與檢測(cè)血清內(nèi)的特異抗體結(jié)合，可在蟲卵周圍形成特殊的復(fù)合物沉淀，在光鏡下判讀反應(yīng)強(qiáng)度并計(jì)數(shù)反應(yīng)卵的百分率稱環(huán)沉率。

　　1.常規(guī)法用載玻片或凹玻片進(jìn)行，加樣本血清后，挑取適量鮮卵或干卵（約100～150個(gè)，從感染動(dòng)物肝分離），覆蓋24×24mm蓋片，四周用石蠟密封，37℃保溫48小時(shí)后，低倍鏡觀察結(jié)果，必要時(shí)需觀察72小時(shí)的反應(yīng)結(jié)果。典型的陽(yáng)性反應(yīng)為泡狀、指狀、片狀或細(xì)長(zhǎng)卷曲狀的折光性沉淀物，邊緣整齊，與卵殼牢固粘連。陰性反應(yīng)必須觀察全片；陽(yáng)性者觀察100個(gè)成熟卵，計(jì)環(huán)沉率及反應(yīng)強(qiáng)度比例。環(huán)沉率是指100個(gè)成熟蟲卵中出現(xiàn)沉淀物的蟲卵數(shù)。凡環(huán)沉率≥5％者可報(bào)告為陽(yáng)性，（在基本消滅和消滅血吸蟲病地區(qū)環(huán)沉率≥3％者可判為陽(yáng)性），1％～4％者為弱陽(yáng)性。環(huán)沉率在治療上具有參考意義。

　　2.分級(jí)強(qiáng)度判定

　　“－”折光淡，與蟲卵似連非連：“影狀”物（外形不甚規(guī)則，低倍鏡下有折光，高倍鏡下為顆粒狀）及出現(xiàn)直徑小于10μm的泡狀沉淀物者，皆為陰性。

　　“＋”蟲卵外周出現(xiàn)泡狀沉淀物（＞10μm），累計(jì)面積小于蟲卵面積的1／2；或呈指狀的細(xì)長(zhǎng)卷曲樣沉淀物，不超過(guò)蟲卵的長(zhǎng)徑。

　　“＋＋”蟲卵外周出現(xiàn)泡狀沉淀物的面積大于蟲卵面積的1／2；或細(xì)長(zhǎng)卷曲樣沉淀相當(dāng)或超過(guò)蟲卵的長(zhǎng)徑。

　　“＋＋＋”蟲卵外周出現(xiàn)泡狀沉淀物的面積大于蟲卵本身面積；或細(xì)長(zhǎng)卷曲樣沉淀物相當(dāng)或超過(guò)蟲卵長(zhǎng)徑的2倍。

　　3.近年來(lái)對(duì)COPT的方法作了一些改進(jìn)如①雙面膠紙條法：將雙面膠紙條制特定的式樣作COPT，可省略蠟封片法的繁瑣步驟，具有操作簡(jiǎn)易，方法規(guī)范，提高工效和避免空氣污染的優(yōu)點(diǎn)。雙面膠紙條法COPT（DGS－COPT）已在現(xiàn)場(chǎng)擴(kuò)大應(yīng)用，今后若能將該法配套干卵，則更能提高它的應(yīng)用價(jià)值；②血吸蟲干卵抗原片（或膜片）環(huán)卵沉淀試驗(yàn)，利用環(huán)卵抗原活性物質(zhì)的耐熱特性，將分離的純卵超聲和熱處理，定量滴加，烤干固定于載玻片或預(yù)制的聚乙稀薄膜上。此種干卵膜片，保存時(shí)間較長(zhǎng)（4℃半年），已有市售商品。試驗(yàn)時(shí)只需加入血清試樣，濕盒孵育，判讀結(jié)果與常規(guī)法相同。干卵膜片法還具有簡(jiǎn)化操作規(guī)程，提高卵抗原的規(guī)范要求，并可長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)。

　　COPT可作為診斷血吸蟲病的血清學(xué)方法之一，及臨床治療病人的依據(jù)；可用作考核治療和防治效果的方法；并且用于血清流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)疫情的方法。

　?。ㄋ模╅g接血凝試驗(yàn)

　　間接血凝試驗(yàn)（indirect　haemagglutination　test，IHA）是以紅細(xì)胞作免疫配體的載體，并以紅細(xì)胞凝集讀數(shù)的血清學(xué)方法。最常用的紅細(xì)胞為綿羊或人（O型）紅細(xì)胞，來(lái)源方便。目前均用醛化紅細(xì)胞，可保存半年而不失其免疫吸附性能。

　　操作步驟如下：

　　1.紅細(xì)胞鞣化和致敏　①取醛化紅細(xì)胞用0.15mol／L，pH7.2PBS離心洗滌2次，并用PBS配成2.5％懸液；②加等量1：2000鞣酸溶液（鞣酸不同批號(hào)，質(zhì)量相差較大必須預(yù)試測(cè)定適宜濃度）37℃孵育20分鐘，經(jīng)常搖動(dòng)；③離心去上清，PBS洗1次，再用0.15mol／L，pH6.4PBS配成10％懸液；④每份懸液加等量適當(dāng)稀釋的抗原液，置于37℃水浴箱中30分鐘（每5分鐘振動(dòng)一次），離心去上清，pH7.2PBS洗2次，再用含1％正常兔血清（NRS）10％蔗糖緩沖液配成5％細(xì)胞懸液。加1‰疊氮鈉防腐，存4℃或減壓凍干備用，每批致敏細(xì)胞均需用已知陽(yáng)性和陰性血清滴定靈敏度或特異性。陽(yáng)性滴度在1：640以上，陰性血清不出現(xiàn)反應(yīng)者可用。

　　2.微量血凝試驗(yàn)　在U型（或V型）微量血凝板上，將被試血清用1％NRS或BSA生理鹽水作倍比系列稀釋，每孔含稀釋血清0.05ml.每孔加0.01ml致敏紅細(xì)胞懸液（可用標(biāo)定過(guò)的OT針頭滴加），充分振蕩搖勻，加蓋于室溫靜置1～2小時(shí)讀取結(jié)果。

　　3.根據(jù)紅細(xì)胞在孔底的沉積類型而定?！埃?，紅細(xì)胞沉于管底，呈圓點(diǎn)形，外周光滑：“±”，紅細(xì)胞沉于管底，周圍不光滑或中心有白色小點(diǎn)：“＋”，紅細(xì)胞沉積范圍很小，呈較明顯的環(huán)形圈：“＋＋”，紅細(xì)胞沉積范圍較小，其中可出現(xiàn)淡淡的環(huán)形圈：“＋＋＋”，紅細(xì)胞布滿管底呈毛玻璃狀：“＋＋＋＋”，紅細(xì)胞呈片狀凝集或邊緣卷曲。呈明顯陽(yáng)性反應(yīng)（＋）的最高稀釋度為該血清的滴度或效價(jià)。

　　目前對(duì)血吸蟲病應(yīng)用純化蟲卵抗原間接血凝試驗(yàn)。采用經(jīng)SephadexG－100柱層析純化的血吸蟲卵抗原致敏紅細(xì)胞作IHA，提高了方法的敏感性，特異性和重現(xiàn)性，為在疫區(qū)擴(kuò)大應(yīng)用提供了條件。

　　IHA操作簡(jiǎn)便，敏感性高，適于現(xiàn)場(chǎng)使用，可作為輔助論斷病人，流行病學(xué)調(diào)查及綜合查病方法。先后在多種寄生蟲感染中應(yīng)用，如血吸蟲，瘧疾、豬囊蟲，旋毛蟲，肺吸蟲，阿米巴，弓形蟲，肝吸蟲等。有些已制成商品診斷藥盒。不足之處是不能提供檢測(cè)抗體的亞型類別，和容易發(fā)生異常的非特異凝集。另外抗原的標(biāo)準(zhǔn)化，操作方法規(guī)范化急待解決，以提高其診斷效果和可比性。

　?。ㄎ澹┟庖邿晒夥?/P>

　　免疫熒光法（immunofluorescent　method，IF）是借抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異熒光染色的診斷技術(shù)。最常用的熒光素為異硫氰基熒光素（fluorescein 　isothiocynate，F(xiàn)ITC）。常用于寄生蟲感染的熒光抗體染色有直接法與間接法。

　　1.直接法　用于檢測(cè)抗原，其缺點(diǎn)是每查一種抗原必須制備與其相應(yīng)的熒光標(biāo)記的抗體。目前很少應(yīng)用。

　　2.間接法　也稱間接熒光抗體法（indirect　fluorescent antibody 　method，IFA）。將抗原與未標(biāo)記的特異性抗體（如患者血清）結(jié)合，然后使之與熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體（抗抗體）結(jié)合，三者的復(fù)合物可發(fā)出熒光。本法的優(yōu)點(diǎn)是制備一種熒光標(biāo)記的抗體，可以用于多種抗原，抗體系統(tǒng)的檢查，即可用以測(cè)定抗原，也可用來(lái)測(cè)定抗體。IFA的抗原可用蟲體或含蟲體的組織切片或涂片，經(jīng)充分干燥后低溫長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩Ｒ粡堓d片可等距置放多個(gè)抗原位點(diǎn)用以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本或確定滴度。

　　IFA的操作步驟如下：①抗原標(biāo)本：用記號(hào)筆或蠟筆將各個(gè)抗原位點(diǎn)圍圈隔離；②在每個(gè)抗原位置滴加已稀釋的血清樣本或樣本稀釋系列，使樣本液充滿圈內(nèi)，置濕匣37℃孵育30分鐘；③用pH8.00.01mol／L PBS沖后再置同樣PBS液中浸泡5分鐘，不時(shí)搖動(dòng)，如此2遍，然后取出吹干；④在抗原位點(diǎn)滴加經(jīng)pH8.0PBS適當(dāng)稀釋的羊抗人IgG熒光抗體（每批結(jié)合物的工作濃度需經(jīng)滴定），使完全覆蓋抗原膜，置濕盒37℃孵育30分鐘；⑤經(jīng)洗滌（同③）后用0.1‰伊文思藍(lán)液復(fù)染10分鐘，然后以PBS流水沖洗0.5～1分鐘，風(fēng)干；⑥用pH8.5或pH8.0碳酸（或磷酸）緩沖甘油封片，也可加一小滴PBS（pH8.0）覆以蓋片鏡檢。鏡檢應(yīng)及時(shí)進(jìn)行以免疫光衰變?？墒褂脽晒夤庠椿蜉p便熒光光源，配以適合的激發(fā)濾片和吸收濾片，在低倍或高倍鏡下檢查。以見(jiàn)有符合被檢物形態(tài)結(jié)構(gòu)的黃綠色清晰熒光發(fā)適合的激發(fā)濾片和吸收濾片，在低倍或高倍鏡下檢查。以見(jiàn)有符合被檢物形態(tài)結(jié)構(gòu)的黃綠色清晰熒光發(fā)光體、而陰性對(duì)照不可見(jiàn)者為陽(yáng)性反應(yīng)。根據(jù)熒光亮度及被檢物形態(tài)輪廓的清晰度把反應(yīng)強(qiáng)度按5級(jí)區(qū)別（＋＋＋，＋＋，＋，±，－）。＋以上的熒光強(qiáng)度為陽(yáng)性。

　　該法具有較高的敏感性、特異性和重現(xiàn)性，應(yīng)用抗原經(jīng)濟(jì)。國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于寄生蟲病的血清學(xué)診斷方法，血清流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)疫情的方法，如主要用于診斷瘧疾、絲蟲病及血吸蟲病，也有用于肺吸蟲病、華支睪吸蟲病、包蟲病及弓形蟲病的血清學(xué)診斷。

　　近10年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)IFA進(jìn)行了很多改進(jìn)。李允鶴等（1984，1988）通過(guò)深入研究，確定了感染鼠肝細(xì)胞內(nèi)蟲卵冰凍切片為IFA較為理想的診斷抗原。該法需用熒光顯微鏡判斷結(jié)果，限制了它的應(yīng)用范圍。但是應(yīng)用該法時(shí)必須具備的熒光抗體，目前國(guó)內(nèi)已有商品供應(yīng)，這為IFA的擴(kuò)大應(yīng)用，提供了條件。

　?。?duì)流免疫電泳試驗(yàn)

　　對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)（counter-immunao　electrophoretic 　assay，CIE）以瓊脂或瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的一種快速，敏感的電泳技術(shù)。

　　對(duì)流電泳較簡(jiǎn)單的擴(kuò)散法和常規(guī)免疫電泳法至少敏感10～20倍，省時(shí)，省料，可用已知抗原檢測(cè)抗體或相反，反應(yīng)結(jié)果特異，陽(yáng)性反應(yīng)的可信度高，適用范圍廣。近年來(lái)本法的改進(jìn)已試用酶或放射標(biāo)記的反應(yīng)配體，如酶標(biāo)記抗原對(duì)流免疫電泳（ELACIE）、放射對(duì)流免疫電泳自顯影術(shù)（RCIEA）等。以克服電泳技術(shù)本身不夠靈敏的弱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)在血吸蟲病、肺吸蟲病免疫診斷已獲良好結(jié)果。國(guó)外報(bào)道應(yīng)用于阿米巴病、錐蟲病、棘球蚴病、旋毛蚴病、血吸蟲病等血清學(xué)診斷。

　?。ㄆ撸┟嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)

　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked　immunosorbent assay.ELISA）簡(jiǎn)稱酶聯(lián)試驗(yàn)，已廣泛用于多種寄生蟲感染的宿主體液（血清，腦脊液等）以及排泄分泌物（尿，乳，糞便等）內(nèi)特異抗體或抗原微粒的檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)要求，試驗(yàn)可分多種類型，常用者有：用于檢測(cè)抗體的間接法；檢測(cè)IgM的雙夾心法；檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法；以固相抗體檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法以及競(jìng)爭(zhēng)抑制法等（圖21－8）。

　　圖21－8　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)常用方法示意圖

　　酶聯(lián)試驗(yàn)的方法根據(jù)所用載體、酶底物系統(tǒng)、觀察反應(yīng)結(jié)果等不同而有很大差別。目前最常用的固相載體為聚苯乙稀微量滴定板，具有需樣少，敏感，重演性好，使用方便等優(yōu)點(diǎn)。酶底物系統(tǒng)也有多種，常用的有辣根過(guò)氧化物酶－鄰苯二胺（HRP－OPD）、堿性磷酸酯酶－硝酚磷酸鹽（AKP－PNP）等，具有較好的生物放大效應(yīng)。其中HRP由于價(jià)廉、易得而被廣泛應(yīng)用。

　　酶聯(lián)試驗(yàn)的基本操作過(guò)程可分為：①固相包被；②溫育洗滌；③加樣；④酶結(jié)合物反應(yīng)；⑤底物顯色；⑥終止反應(yīng)讀取結(jié)果等若干步驟。溫育和洗滌需貫穿在每二步驟之間，用以去除多余的反應(yīng)物。以下為臨床上最常用的間接法（檢測(cè)抗體）和雙抗體夾心法（檢測(cè)抗原）的操作程序：

　　⑴間接法：

　　1）以包被液（碳酸鈉－碳酸氫鈉緩沖液0.05mol／L，pH9.6）稀釋抗原（常用5～10μg/ml），每孔0.1（或0.2）ml包被反應(yīng)板，37℃濕盒溫育2～3小時(shí)或4℃過(guò)夜；

　　2）棄去包被液，反應(yīng)板用去離子水或PBS－Tween液（0.005mol／L PBS含0.05％Tween-20）沖洗3次，甩干；

　　3）用樣本稀釋液（0.05mol／L PBS含0.05％Tween-20）稀釋樣本（起始濃度≥100－1），用樣本稀釋液（每孔0.1（或0.2）ml，溫育1小時(shí)；

　　4）棄去樣液，如上沖洗，甩干加稀釋結(jié)合物（市售品常稀釋至100－1，用樣本稀釋液），每孔0.1（或0.2）ml，溫育1～2小時(shí)；

　　5）如上沖洗甩干后即刻加入新鮮配制的底物系統(tǒng)，每孔0.1（或0.2）ml，置暗盒室溫15分鐘；

　　6）終止反應(yīng)：HRP－OPD系統(tǒng)每孔加1mol／LH2SO450μl；

　　7）目測(cè)或用分光光度計(jì)在400μm波段測(cè)定吸收值來(lái)判斷。

　?、齐p抗體夾心法：

　　1）以包被液稀釋抗體（如兔抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原的抗體，抗SEA－IgG）包被反應(yīng)板（1～1000μg/ml），方法同間接法包被抗原；

　　2）沖洗，甩干，加樣溫育同前（起始濃度≥5－1）；

　　3）加結(jié)合物（例如抗SEA－IgG－HRP），適宜工作濃度需先經(jīng)方陣滴定確定；

　　4）以下各步同間接法。

　　若包被抗體與第二抗體來(lái)自不同種的供體則可應(yīng)用市售抗免疫球蛋白結(jié)合物。例如包被抗體為羊抗SEA，二抗用兔抗SEA則在未標(biāo)記的二抗溫育洗滌后加羊抗兔IgG結(jié)合物（GAP－HRP）。

　　[附]酶標(biāo)記物制備：應(yīng)用抗原或抗體與酶分子的交聯(lián)技術(shù)，交聯(lián)物亦稱酶結(jié)合物（conjugate）。根據(jù)酶與抗體（抗原）的激活順序，交聯(lián)反應(yīng)可分一步法、二步法及三步法不等。其中以二步法中的過(guò)碘酸鈉法多用，戊二醛一步法反應(yīng)率較低，較適用于交聯(lián)AKP.免疫球蛋白標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（過(guò)碘酸鈉法）與免疫球蛋白標(biāo)記堿性磷酸脂酶（戊二醛一步法），按常規(guī)方法制備。

　　抗IgG型抗體酶結(jié)合物也可用金黃色葡萄球菌A－蛋白酶結(jié)合物替代，稱A－蛋白酶聯(lián)試驗(yàn)（SPA－ELISA）。A－蛋白辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物（PA－HRP）已有市售標(biāo)準(zhǔn)品，其敏感度稍遜于抗體酶結(jié)合物。

　　底物配制：不同的酶要求選擇相應(yīng)底物，以下為分別適用于比色和肉眼讀取結(jié)果的兩種HRP常用底物配制。

　　鄰苯二胺（OPD）：經(jīng)HRP催化后生成橘紅色產(chǎn)物。40mgOPD溶于檸檬酸磷酸緩沖液（pH5.0）100ml（含24.3ml 0.1mol／L檸檬酸，25.7ml0.02mol／L Na2HPO4加水50ml），臨用前加30％H2O20.15ml，溫育15分鐘后用2mol／l H2SO4終止反應(yīng)，492nm讀數(shù)。本底物具高度敏感性，顯色梯度良好，生成可溶性產(chǎn)物，有利于比色讀數(shù)，但為光敏感，反應(yīng)時(shí)應(yīng)置暗盒內(nèi)；也具致突變作用。

　　5－氨基水楊酸（5AS）：經(jīng)HRP催化生成棕色產(chǎn)物。8mg5AS溶于10ml50℃溫?zé)嵴麴s水中，置4℃暗處不超過(guò)3天，臨用前以1n NaOH調(diào)pH至6.0，加0.05％H2O2 1ml.37℃經(jīng)30～60分鐘溫浴后用1n NaOH終止反應(yīng)，肉眼或449nm比色。本底物無(wú)致突變作用，生成棕褐色不全溶解的產(chǎn)物有利于肉眼判讀結(jié)果。

　　酶聯(lián)試驗(yàn)為高靈敏檢測(cè)技術(shù)，結(jié)果可定量表示，可檢測(cè)抗體、抗原或特異性免疫復(fù)合物，微量滴定板法消耗樣本試劑少，能供全自動(dòng)操作，適用批量樣本檢測(cè)，因此在寄生蟲感染的研究和診斷領(lǐng)域乃至血清流行病學(xué)均被廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外有多種寄生蟲感染的酶聯(lián)藥籍出售，包括有血吸蟲病、弓形蟲病、阿米巴病、絲蟲病、蛔蟲病、旋毛蟲病和犬蛔蟲病等，ELISA可用作輔助診斷病人，血清流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)疫情的方法。酶聯(lián)試驗(yàn)操作程序的簡(jiǎn)單快速不如IHA，但方法具有很大所改良潛力和適應(yīng)范圍。判斷結(jié)果需用分光光度計(jì)，限制了擴(kuò)大應(yīng)用；另外，應(yīng)用抗原及酶結(jié)合物尚需進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化，操作方法也應(yīng)規(guī)范化。

　　近年來(lái)已有多種改進(jìn)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)如①快速－ELISA：改進(jìn)特點(diǎn)為用PVC薄膜代替聚苯乙烯微量反應(yīng)板作載體；將1％可溶性血吸蟲卵抗原與尿素溶解性血吸蟲卵抗原等量相混合預(yù)吸附于薄膜上；用抗人Igg McAb代替羊抗人IgG制備酶結(jié)合物；用底物TMB代替OPD.該法主要以目視法判斷結(jié)果，整個(gè)操作流程僅需20min左右。②硫酸銨沉淀抗原－ELISA：可溶性血吸蟲卵抗原經(jīng)飽和硫酸銨沉淀后用作ELISA診斷抗原；在系列實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，使操作方法達(dá)到規(guī)范化；用質(zhì)量控制圖控制檢測(cè)差異，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線單位判斷結(jié)果；縮短檢測(cè)時(shí)間，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，節(jié)省試液用量，提高了敏感性，特異性和重現(xiàn)性。

　?。ò耍┌唿c(diǎn)ELISA

　　斑點(diǎn)ELISA（dot-ELISA）是近年新發(fā)展的一種ELISA技術(shù)，選用對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)吸附能力的硝酸纖維素薄膜作固相載體，底物經(jīng)酶促反應(yīng)后形成有色沉淀物使薄膜著色，然后目測(cè)或用光密度掃描儀定量。dot-ELISA可用來(lái)檢測(cè)抗體，也可用來(lái)檢測(cè)抗原，由于該法檢測(cè)抗原時(shí)操作較其他免疫學(xué)試驗(yàn)簡(jiǎn)便，故目前多用于抗原檢測(cè)。

　　操作方法將待檢血清作1：1～1：20稀釋，用微量加樣器將1μl血清點(diǎn)滴于硝酸纖維素膜（NC）上，置于70℃經(jīng)1h，將NC浸于1％BSA－PBS中，室溫?fù)u蕩1小時(shí)，洗滌2次，加1：1000稀釋的McAb酶標(biāo)記物，室溫?fù)u蕩2小時(shí)，洗滌3次后，加底物3，3‘二氨基聯(lián)苯胺或4氯－1－乙萘酚，15分鐘后，流水終止反應(yīng)，以目視法判斷結(jié)果。凡顯示棕色斑點(diǎn)者為陽(yáng)性，否則為陰性。以產(chǎn)生棕色斑點(diǎn)反應(yīng)的最高稀釋度為抗原滴度。

　　該法簡(jiǎn)易，快速，適合于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，有廣闊的應(yīng)用前景。現(xiàn)有的資料初步證明具有診斷病人和考核治療效果，國(guó)內(nèi)已用于血吸蟲病，瘧疾，絲蟲病，棘球蚴病的診斷。國(guó)內(nèi)學(xué)者曾比較斑點(diǎn)ELISA和雙抗體夾心ELISA用于檢測(cè)班氏絲蟲病人循環(huán)抗原。采用相同的單克隆抗體和病人血清進(jìn)行兩種方法對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)的特異性均大于95％，但是它們的敏感性有明顯不同，斑點(diǎn)ELISA能檢測(cè)出血清中0.055ng/ml微絲蚴抗原，而雙抗體夾心ELISA僅能測(cè)出≥10ng/ml抗原；并且前者不需要特殊的設(shè)備，適用于絲蟲病流行區(qū)。另有報(bào)告用單克隆抗體－抗原斑點(diǎn)試驗(yàn)（McAb-AsT）檢測(cè)血清抗原診斷黑熱病，效果較為滿意，方法上進(jìn)一步簡(jiǎn)化，加樣以原濃度血清反應(yīng)，效果最佳。國(guó)外還用于旋毛蟲病、絲蟲病、弓形蟲病以及肺孢子蟲病的血清學(xué)診斷方法。

　?。ň牛┟庖呙溉旧囼?yàn)

　　免疫酶染色試驗(yàn)（immunoenzymic　staining　test，IEST）是以含寄生蟲病原的組織切片，印片或培養(yǎng)物涂片用作抗原進(jìn)行過(guò)氧化物酶特異免疫染色后在光鏡下檢示樣本中的特異性抗體。在蠕蟲和原蟲感染中均有多種應(yīng)用。

　　操作過(guò)程抗原組織作冰凍（5～10μm）或石蠟連續(xù)切片（4～8μm）排列于載玻片，經(jīng)丙酮固定貯存于－20℃?zhèn)溆谩Ｔx純培養(yǎng)亦可制成分隔涂片，方法均同熒光染色法抗原制片。試驗(yàn)時(shí)先將抗原片在稀釋的過(guò)氧化氫溶液浸泡15分鐘，除去可能存在于組織中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；抗原片用PBS沖洗后經(jīng)Tris緩沖液（PBS，pH7.6）10倍稀釋的正常兔或羊血清培育10分鐘，迅速以PBS洗滌后加檢測(cè)樣本（單個(gè)或系列稀釋度），置濕盒室溫（20～25℃）或37℃培育30分鐘；PBS洗滌3次，每次5分鐘，然后加兔或羊抗人過(guò)氧化物酶結(jié)合物（參照ELISA法），結(jié)合物中可加入所用抗原組織片供體動(dòng)物血清約1／25～1／3體積，用以阻斷可能交叉反應(yīng)，降低背景色度；抗原片以PBS洗滌3次后加聯(lián)苯胺（DAB）底物溶液（飽和聯(lián)苯胺液加等量pH7.6硼酸緩沖液，用前按9：1體積加入0.1％H2O2液），室溫顯色10～15分鐘后在光鏡下觀察反應(yīng)結(jié)果。

　　反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)：“－”，組織內(nèi)抗原部位不呈現(xiàn)棕紅色：“＋”，組織內(nèi)抗原部位（如血吸蟲肝卵切片中的蟲卵）呈現(xiàn)棕紅色：“＋＋”，局部呈現(xiàn)清晰的棕紅色：“＋＋＋”，呈現(xiàn)非常清晰的棕紅色。

　　該法簡(jiǎn)單，節(jié)省抗原；判斷結(jié)果不需要特殊儀器；適合于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。IEST可用作輔助診斷病人，考核療效，血清流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)疫情的方法。目前主要應(yīng)用于血吸蟲病、絲蟲病及囊蟲病診斷，也可用來(lái)診斷華支囊吸蟲病、肺吸蟲病、包蟲病和弓形蟲病。

　　目前對(duì)該方法改進(jìn)有：①用感染鼠肝組織內(nèi)蟲卵制成7μm厚度冰凍切片（或石蠟切片）作為診斷用固相抗原代替可溶性血吸蟲卵抗原作IEST，具有取材容易和應(yīng)用抗原經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。②將冰凍切片置于載玻片上，可以反復(fù)使用載玻片，較一次性用的PVC薄膜／苯氯乙烯反應(yīng)板價(jià)廉，顯著地降低了檢測(cè)費(fèi)用。③判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)用普通光鏡即可。染色標(biāo)本不必即時(shí)檢查?？杀４婧荛L(zhǎng)時(shí)間，便于復(fù)查。④陽(yáng)性血清作最高滴度，可定量抗體水平，用作考核療效有及防治效果的指標(biāo)。⑤IEST的反應(yīng)基本原理與COPT相似，但前者應(yīng)用切片蟲卵代替了COPT的整個(gè)干卵，前法的反應(yīng)快速（約1.5～2小時(shí)）而后法較緩慢（需48～72小時(shí)）。為此，IEST彌補(bǔ)了COPT診斷時(shí)，漏檢病人和取得結(jié)果不快速的缺陷。病鼠肝組織內(nèi)蟲卵冰凍切片抗原IEST，目前已在疫區(qū)擴(kuò)大應(yīng)用?，F(xiàn)已研制成試劑盒，批量生產(chǎn)，供應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)需用。

　?。ㄊ┟庖哂n試驗(yàn)

　　免疫印漬試驗(yàn)（immunoblot或Western　blot）是由十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），電泳轉(zhuǎn)印及標(biāo)記免疫試驗(yàn)三項(xiàng)技術(shù)結(jié)合而成的一種新型的免疫探針技術(shù)（immuno-probing 　technique），是用于分析蛋白抗原和鑒別生物學(xué)活性抗原組分的有效方法，近年已應(yīng)用于檢測(cè)寄生蟲感染宿主體液內(nèi)針對(duì)某分子量抗原的相應(yīng)循環(huán)抗體成分或譜型。是為一項(xiàng)高敏感和高特異的診斷方法，具有很大發(fā)展?jié)摿?。用于診斷的免疫印漬試驗(yàn)以采用酶標(biāo)記的探針（即二抗及其標(biāo)記結(jié)合物）為安全方便，稱酶免疫轉(zhuǎn)移印漬試驗(yàn)（enzyme 　immuno-transfer　blotting，EITB）。

　　1.操作程序（以血吸蟲EITB為例）

　?、艠颖痉蛛x：

　　1）取日本血吸蟲新鮮成蟲按5～10對(duì)／1.5ml比例加樣本緩沖液，勻漿，置沸水浴2分鐘，離心（10000g，30分鐘），取上清液備用。

　　2）上述成蟲抗原樣本進(jìn)行單梳SDS－PAGE電泳分離。左側(cè)梳孔加標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，梳孔右側(cè)樣槽加抗原液，電壓控制在160～180V之間。

　　⑵電泳轉(zhuǎn)?。?/P>

　　1）從電泳板中取出已完成電泳的凝膠片浸泡于盛有轉(zhuǎn)印緩沖液（TB）的搪瓷盤　內(nèi)。

　　2）在TB液內(nèi)組成轉(zhuǎn)印夾心板層：取相應(yīng)大小的硝酸纖維（NC）薄膜，徐徐浸泡在TB液，將凝膠片與薄膜光面緊貼。兩面各放置浸濕濾紙兩層而后海綿墊（厚0.5～1cm）一層，做好方位標(biāo)記，最后夾于二層有孔塑料襯板之間，絕對(duì)避免各層之間留有氣泡。

　　3）將TB倒入轉(zhuǎn)印槽中，然后插入轉(zhuǎn)印板，使凝膠片位于陰極側(cè)，NC薄膜位于陽(yáng)極側(cè)。

　　4）置轉(zhuǎn)印槽于4℃冰箱內(nèi)，通電轉(zhuǎn)印數(shù)小時(shí)或過(guò)夜，電流控制在250mA上下（約40～50V）。

　?、翘结槞z測(cè)：

　　1）取出轉(zhuǎn)印好的NC薄膜，水平地放入猝滅劑中，室溫?fù)u動(dòng)1小時(shí)以封閉未吸附蛋白質(zhì)的區(qū)域，然后用洗滌緩沖液選2～3次，每次30分鐘以除去亦性劑，使蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)和生物學(xué)特性得以恢復(fù)。

　　2）平置NC薄膜于浸有Tris-緩沖鹽水（TBS）的濾紙上，用刀片將薄膜按電泳方向分割為寬約0.5cm的直條，用鉛筆做好上端標(biāo)記。

　　3）取其中一個(gè)細(xì)條，并同標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶一起作氨基黑染色（也可用考馬斯亮藍(lán)染或銀染）測(cè)試分離效果并確定分子量位置。其余細(xì)條晾干后置4℃作印漬試驗(yàn)備用（抗原活性可保持3個(gè)月以上）。

　　⑷印漬試驗(yàn)：

　　1）置上述抗原條于分格反應(yīng)板的反應(yīng)槽內(nèi)，正面向上，每槽一條，預(yù)先用0.05%TBS-Tween液浸濕（TBS-T）；2）被檢血清用TBS-T液稀釋（常用1：150），加入反應(yīng)槽中，以浸沒(méi)膜條為限。通常需0.5～1.5ml，相當(dāng)于10μl血樣量（每槽加液量下同）；3）室溫（20～25℃）振蕩60分鐘，以后用TBS-T洗6次，每次3分鐘；4）加已稀釋的羊抗人酶結(jié)合物，溫育1.5小時(shí)，洗滌如上；5）加入新鮮配制的底物溶液（TBS50ml+0.3%萘酚甲醇液3ml+30%H2O210μl；或二氨基聯(lián)苯胺，DAB，5mg/ml 0.05mol/L檸檬酸磷酸緩沖液，pH5.0，每60ml加3%H2O220ul和1%COCl20.2ul 和1%COC120.6ml）；6）15分鐘后用蒸餾水沖洗數(shù)次以終止反應(yīng)，薄膜條取出置玻板自然干燥；7）陽(yáng)性反應(yīng)可見(jiàn)藍(lán)黑色（4氯1萘酚底物）或棕褐色（DAB）條帶。

　　2.主要試劑

　?、艠颖揪彌_液：含甘油10ml，2-巰基乙醇5ml，10%SDS30ml.⑵轉(zhuǎn)印緩沖液（TB）：Tris 3g，甘氨酸14g，甲醇250ml，水加至1000ml.⑶Tris緩沖鹽水（TBS）：10mmol/L，Tris含0.9%NaCl，用1N HC1調(diào)pH至7.4.⑷TBS-T液：TBS液內(nèi)含0.05%Tween-20于TBS液。

　?、赦鐒?%～5%BSA或0.1%～0.3%Tween-20于TBS液。

　　⑹氨基黑染液：0.1%W/V氨基黑（C. I. 20470），45%V/V甲醇，10%V/V冰醋酸。

　　脫色液：90%V/V甲醇，2%冰醋酸。

　　EITB用作鑒定寄生蟲抗原的特定組分蛋白及診斷寄生蟲病的方法。在國(guó)外已成功地用于艾滋病的常規(guī)診斷，并且在瘧原蟲、弓形蟲、血吸蟲、肺吸蟲、包蟲等的研究分析方面有很多報(bào)道。國(guó)內(nèi)用于檢測(cè)包蟲病患者血清抗體也獲良好結(jié)果，初步應(yīng)用于血吸蟲感染現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，用上述抗原及操作程序可檢示特異的抗腸相關(guān)31/32kD診斷蛋白抗體的條帶，呈現(xiàn)特異和敏感的特性。用本法對(duì)感染宿主不同病期抗體譜型的研究，可望獲得有效化療后早期隱退的特異條帶。批量制備抗原分離的薄膜條帶，有可能成為適用于現(xiàn)場(chǎng)查病的特異性診斷藥盒，不鐵為一項(xiàng)具有診斷潛能的新技術(shù)。

　?。ㄊ唬╇s交瘤技術(shù)制備單克隆抗體

　　經(jīng)十多年的研究，單克隆抗體（McAb）廣泛用于寄生蟲病臨床與實(shí)驗(yàn)研究。如寄生蟲蟲種與蟲株的分型和鑒定；建立以檢測(cè)循環(huán)抗原為主的免疫診斷方法；分析和純化抗原制備靶抗原；以及寄生蟲感染免疫，保護(hù)性免疫和蟲苗制備等方面，目前，國(guó)內(nèi)外有報(bào)告，McAb用于瘧疾、弓形蟲病、血吸蟲病、肺吸蟲病、棘球蚴病、絲蟲病等方面。有關(guān)McAb在瘧疾中的應(yīng)用，如對(duì)蟲種，蟲株的鑒定與分型，通過(guò)采用McAb對(duì)環(huán)孢蛋白（circumsporozoite 　protein，CSP）抗原及裂殖體糖蛋白研究，為瘧原蟲分型鑒定提供了新的依據(jù)；單克隆抗體的應(yīng)用又為提高臨床免疫診斷價(jià)值提供了極好的工具，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)已有報(bào)告采用McAb雙夾心斑點(diǎn)金銀染色法和雙夾心斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以檢測(cè)瘧原蟲循環(huán)抗原，陽(yáng)性率分別達(dá)90%～93.3%和85%～86.7%，具有較高的特異性和重復(fù)性，另外發(fā)現(xiàn)某些抗子孢子、裂殖體（子）和配子體的單克隆抗體具有保護(hù)作用。保護(hù)性McAb的發(fā)現(xiàn)不僅為制備蟲苗的靶抗原提供了條件，而且為進(jìn)行被動(dòng)免疫開辟了途徑。

　　在血吸蟲病方面，單克隆抗體已應(yīng)用于血吸蟲抗原分析，免疫學(xué)診斷和保護(hù)性免疫研究，國(guó)內(nèi)外均已報(bào)道采用檢測(cè)血吸蟲循環(huán)抗原，如Sj23，Sm38，Sj70等抗原，其陽(yáng)性率在90%～97%，交叉反應(yīng)低且有良好的療效考核價(jià)值，有關(guān)保護(hù)性免疫研究方面，主要集中在分子量分別為28kD和38kD的抗原，現(xiàn)有資料初步表明以McAb提純的28kD抗原免疫大白鼠后，可獲得70%的保護(hù)率。

　　在絲蟲病方面，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)已制備出識(shí)別馬來(lái)微絲蚴表面分子量分別為70kD、75kD、110kD等抗原的McAb，某些McAb能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞粘附于微絲蚴表面，引起蟲體死亡。將這些McAb被動(dòng)轉(zhuǎn)移給受體動(dòng)物，在體內(nèi)能降低微絲蚴血癥。

　?。ㄊ〥NA探針技術(shù)

　　DNA技術(shù)（probe）技術(shù)，又稱核酸分子雜交（molecular 　hybridization）技術(shù)，最近幾年迅速發(fā)展起來(lái)的一種敏感性高，特異性強(qiáng)，應(yīng)用面廣的研究手段。在寄生蟲病診斷中，探針是病原體的特異核酸序列，可用來(lái)檢測(cè)出病原體是否存在，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于獲得特異的核酸探針。近10年來(lái)應(yīng)用特異的核酸探針鑒定寄生蟲和診斷寄生蟲病的研究報(bào)道較多，現(xiàn)有資料表明，DNA探針檢測(cè)，其特異性和敏感性高；并且DNA探針是直接檢測(cè)寄生蟲的基因，故比血清學(xué)方法可靠；又因探針DNA較穩(wěn)定，在合適條件下可較長(zhǎng)期保存；在試驗(yàn)條件不變時(shí)試驗(yàn)結(jié)果的重演性較好。在寄生蟲病的診斷、現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、寄生蟲種的鑒定及分類等方面的研究中均已使用了DNA探針技術(shù)，內(nèi)容包括原蟲、吸蟲、線蟲、絳蟲、昆蟲的鑒定和致病的診斷。另外，核酸探針已成功地用于許多傳播媒介體內(nèi)寄生蟲的鑒定。但是一般尚在實(shí)驗(yàn)階段。可望能用作高效和準(zhǔn)確的寄生蟲病血清學(xué)方法，用以制備經(jīng)濟(jì)和理想的診斷抗原。

　?。ㄊ㏄CR技術(shù)

　　檢測(cè)病原體遺傳物質(zhì)用以診斷寄生蟲病的方法，除分子雜交技術(shù)外，新近發(fā)展的更靈敏、快速，并且不需要同位素標(biāo)記的基因擴(kuò)增技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase 　chain　reaction，PCR）是一種體外擴(kuò)增特異性DNA技術(shù)。

　　現(xiàn)已使用PCR技術(shù)于寄生蟲病診斷，如錐蟲病、利什曼病、肺孢子蟲病、腸球蟲病、賈第蟲病、弓形蟲病等，在一些疾病中，有時(shí)原蟲數(shù)量極少，用一般方法無(wú)法檢測(cè)，經(jīng)用PCR擴(kuò)增DNA模板，提供了一條解決診斷的途徑。如在檢測(cè)錐蟲時(shí)，PCR擴(kuò)增純化DNA可使探針檢測(cè)到血樣中1個(gè)蟲體；國(guó)內(nèi)建立了弓形蟲病PCR診斷方法，具有高度特異、敏感且快速的優(yōu)點(diǎn)。今后在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域中將會(huì)更廣泛深入地開展PCR技術(shù)的應(yīng)用。