?。坳P鍵詞］ 腫瘤；微轉(zhuǎn)移；機制；檢測

　　The Mechanisms and Detection of Tumour Micrometastasis

　　Key words： Tumor； Micrometastasis；Mechanisms；Detection

　　轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學特性之一，也是影響腫瘤患者預后的重要因素。近幾年，腫瘤轉(zhuǎn)移的研究已發(fā)展到細胞及分子水平，腫瘤微轉(zhuǎn)移的概念也已逐步建立。準確判斷有無腫瘤轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移的范圍，可大大提高腫瘤治療的有效率，改善患者的預后。然而，臨床及常規(guī)病理檢查很難發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞，只有通過免疫組化或PCR等特殊檢查才能確定。本文就腫瘤微轉(zhuǎn)移的機制及檢測途徑作一簡要綜述。

　　1.微轉(zhuǎn)移的概念

　　自1869年首次報道并證實外周血中發(fā)現(xiàn)瘤細胞以來，微轉(zhuǎn)移的研究逐漸成為腫瘤研究的一個熱點。微轉(zhuǎn)移（micrometastases）是指在各種機體組織、體液及細胞移植物中檢測到的鏡下及亞顯微水平的腫瘤殘留，是用常規(guī)臨床病理學方法不能檢出的、隱匿在原發(fā)灶以外組織的、非血液系統(tǒng)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移［1］。1993年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）出版的《腫瘤TNM分期補充材料》中指出，當遠處轉(zhuǎn)移灶生長至直徑1 mm～2 mm時，稱作微轉(zhuǎn)移。

　　2.腫瘤微轉(zhuǎn)移的機制

　　關于腫瘤轉(zhuǎn)移存在兩種學說，一是“種子與土壤假說”：認為是否形成腫瘤轉(zhuǎn)移要看被轉(zhuǎn)移部位組織的環(huán)境是否適宜原發(fā)瘤細胞的停留和生長。這種學說認為，人體大部分轉(zhuǎn)移瘤細胞由于受到免疫機制的殺傷或者轉(zhuǎn)移瘤細胞局部環(huán)境不適宜而不能存活；只有少數(shù)細胞具有活力，在轉(zhuǎn)移部位組織生長繁殖，形成轉(zhuǎn)移瘤［2］。二是腫瘤異質(zhì)性理論：該理論認為由于瘤細胞遺傳性狀的不穩(wěn)定，由單克隆起源的瘤細胞在不斷增殖的過程中會發(fā)生異質(zhì)性，導致瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能有高低之分［3］。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程，其轉(zhuǎn)移主要有3種途徑：經(jīng)血道轉(zhuǎn)移、經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移、直接侵及周圍組織器官和播散至體腔。腫瘤淋巴管、細胞因子的作用以及微環(huán)境的影響對原發(fā)瘤播散至遠處組織器官起了很大的作用。

　　2.1  腫瘤淋巴管生成  由于毛細淋巴管無完整的基底膜，管壁薄，內(nèi)皮細胞間有短暫裂隙，通透性高，有利于瘤細胞的進入，故在早期腫瘤轉(zhuǎn)移以淋巴道為主。淋巴管不僅參與腫瘤錨定生長所必需的基質(zhì)成分的形成，而且當腫瘤實體長到1 mm～2 mm 時，腫瘤血管生成的過程也需要淋巴管參與。腫瘤缺氧壞死也與缺乏完善的淋巴管系統(tǒng)有密切關系，前哨淋巴結(jié)的活檢已被應用于一些惡性腫瘤（如乳腺癌和黑色素瘤） 的診斷和分期。近期有學者認為，腫瘤新生淋巴管是淋巴道轉(zhuǎn)移的主要原因，且在淋巴管生成中淋巴管生成因子VEGFC和VEGFD起著關鍵作用。在人的某些自發(fā)性癌轉(zhuǎn)移模型和一些動物實驗中證明VEGFC和VEGFD有促進腫瘤新生淋巴管形成的能力［4］。隨著對VEGFC和VEGFD研究的逐步深入，有學者［5］認為VEGFD的表達在某些腫瘤中與新生淋巴管的形成成負相關。目前，在實體瘤中淋巴管的存在與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的關系上仍然存在較大分歧，Leu 等［6］認為腫瘤中缺乏功能性淋巴管，而McCarter 等［7］則認為，淋巴管的生成是一個成功的腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移實驗模型的樞紐。

　　2.2  細胞因子的作用  惡性細胞間的相互粘著力較正常細胞間低，腫瘤細胞從原發(fā)部位脫落， 侵入細胞外基質(zhì)與基底膜中大分子蛋白粘附，啟動細胞合成并分泌各種降解酶類，降解基底膜（BM）及細胞外基質(zhì)（ECM），穿過脈管壁進入循環(huán)系統(tǒng)，在循環(huán)中逃避免疫系統(tǒng)攻擊，最后穿過脈管，外滲達繼發(fā)部位形成克隆，增殖形成轉(zhuǎn)移灶。癌細胞在轉(zhuǎn)移過程中，需2次侵襲周圍組織，2次穿越血管和淋巴管基底膜。在此過程中有多種因子參與：運動因子如分裂素能刺激細胞的遷移、趨化、吞噬等；細胞粘附因子（Cell Adhesion Molecules，CAMS ）如整合蛋白、鈣粘蛋白、免疫球蛋白超家族及選擇素是介導細胞和細胞，細胞和細胞外基質(zhì)粘附和相互作用的轉(zhuǎn)膜糖蛋白，參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移；腫瘤細胞產(chǎn)生的胞外基質(zhì)降解酶如組織蛋白酶、金屬蛋白酶等可降解基質(zhì)使腫瘤細胞易于遷移； 歸巢因子中的尋址素和歸巢受體是一組能幫助腫瘤細胞找尋轉(zhuǎn)移靶器官的因子，位于癌細胞的歸巢受體與位于內(nèi)皮細胞的尋址素共同作用，使癌細胞離開血循環(huán)到達特定的器官；新近又發(fā)現(xiàn)一類誘導細胞移動的趨化因子（Chemokines），可直接調(diào)控腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化和生長，調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞定向移動，導致腫瘤細胞向遠處轉(zhuǎn)移。［醫(yī)學教育網(wǎng)  搜集整理］

　　2.3  微環(huán)境的影響  微環(huán)境因素以及腫瘤和宿主細胞間生物鏈對決定微轉(zhuǎn)移灶的生存和生長可能具有關鍵的作用。一定的微環(huán)境對于一些腫瘤的繁殖可能是有利的，但對于其他腫瘤則是不利的，具有明顯的器官傾向性。同時有動物實驗證明，將不同的瘤細胞經(jīng)靜脈接種于大鼠體內(nèi)，其轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生部位不同，實驗的結(jié)果表明不同的瘤細胞在不同臟器內(nèi)轉(zhuǎn)移的分布上有明顯的不同，對于每一種腫瘤都是高度特異的［8］。瘤細胞轉(zhuǎn)移的器官特異性是由于轉(zhuǎn)移的瘤細胞高表達靶器官內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的粘附分子的配體， 腫瘤細胞與靶器官內(nèi)皮細胞特異性粘附以及靶器官內(nèi)生長因子對腫瘤細胞生長的影響，是構(gòu)成器官特異性轉(zhuǎn)移的主要機制［9］。各種腫瘤和宿主微環(huán)境之間關系不會完全一樣，因而在器官特異性轉(zhuǎn)移過程中，在不同器官中起主要作用的瘤細胞或宿主靶器官作用的特殊性也有所不同。

　　3. 腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測

　　目前，在臨床上，許多惡性腫瘤的原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移灶雖然經(jīng)手術(shù)根治切除，甚至常規(guī)病理學檢查為轉(zhuǎn)移陰性的患者，部分仍死于腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。這可能與已存在的血循環(huán)、骨髓、淋巴道和不同組織器官的腫瘤微轉(zhuǎn)移有關，因此，腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測具有重要意義。選擇合適的方法及腫瘤標志物，可明顯提高微轉(zhuǎn)移的檢出率。

　　3.1  常規(guī)連續(xù)切片HE染色法  連續(xù)切片法一般用于淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移檢測，其檢出率與切片間距有很大關系，連續(xù)切片的細致分析，可從常規(guī)單張切片檢查陰性的淋巴結(jié)中檢出10%左右的微轉(zhuǎn)移［10］，而連續(xù)切片法一個標本需切幾十至幾百張切片，工作量大，臨床難以推廣，且對未形成轉(zhuǎn)移灶的少量癌細胞難以檢出，故近年來已很少使用。

　　3.2  免疫組化法  腫瘤細胞均具有各自特異的細胞標志物，免疫組化法就是選用針對腫瘤細胞特異標志物的抗體，用顯色劑標記，在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的成色反應，對組織切片、細胞涂片進行染色，以尋找組織、血液、淋巴結(jié)、骨髓中的腫瘤細胞，以達到微轉(zhuǎn)移檢測的目的，并且可直接觀察微轉(zhuǎn)移細胞的形態(tài)。由于操作較簡便，成本相對較低， 敏感性和特異性較高， 該技術(shù)較早應用于臨床。該方法的不足之處在于費時，費用較昂貴，且因單抗之間存在交叉反應， 腫瘤細胞表面抗原表達分布的不均質(zhì)性、存在實際陽性染色結(jié)果判斷操作的標準化問題，易出現(xiàn)假陽性、假陰性結(jié)果。特異性抗體也可用熒光標記，采用附計算機裝置的熒光顯微鏡對免疫熒光標記細胞進行掃描，可消除內(nèi)源性堿性磷酸酶的影響，確定腫瘤細胞的絕對數(shù)目，微轉(zhuǎn)移腫瘤細胞具有特異性免疫熒光可存盤，進一步作形態(tài)學、免疫學以及分子和細胞遺傳學分析。

　　3.3  流式細胞術(shù)  流式細胞術(shù)（flow cytometry ， FCM）的基本原理是用熒光標記的單抗與腫瘤細胞結(jié)合后，通過流式細胞儀即可檢測到腫瘤細胞，其最大優(yōu)點是可以對骨髓樣品中的腫瘤細胞進行直接計數(shù)，并且能夠?qū)⑦@些細胞分離進行進一步研究［11］。這一過程是完全自動化的，排除了主觀因素的干擾。孫玲等［12］ 利用FCM檢測96例非小細胞肺癌患者骨髓微轉(zhuǎn)移，并且以非癌患者和正常人為對照，以實驗組樣品細胞FI值大于對照組細胞表達熒光強度的上限值（±2S）判為陽性，結(jié)果經(jīng)手術(shù)治療的非小細胞肺癌患者術(shù)前骨髓微轉(zhuǎn)移檢出率為26%.該方法雖然能進行細胞定量計數(shù)，但不能提供細胞形態(tài)學依據(jù)，同時由于儀器昂貴，非普通實驗室所能承受，限制了該技術(shù)的推廣。

　　3.4  聚合酶鏈反應和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（PCR和 RTPCR）  該技術(shù)的原理是通過在患者的血液、淋巴結(jié)、骨髓中擴增出腫瘤細胞標志性基因或靶RNA來證實腫瘤細胞的存在。應用PCR技術(shù)可擴增存在于腫瘤細胞內(nèi)的異常DNA，首先要明確原發(fā)灶內(nèi)有無腫瘤細胞基因突變以及突變類型，若未測得突變則不能應用PCR技術(shù)對待測轉(zhuǎn)移位點進行微轉(zhuǎn)移檢測。RTPCR技術(shù)是通過擴增腫瘤細胞特異的或組織特異的標志物基因信使RNA來檢測腫瘤細胞的存在的。RTPCR 檢測腫瘤基因標志物是目前認為最適于發(fā)現(xiàn)腫瘤早期轉(zhuǎn)移的方法，其靈敏度可達10-7～10-8 ，尤其適用于微量樣本中目的基因的獲取或微量腫瘤細胞的檢測。用免疫組化等方法檢測結(jié)果為陰性時，仍可用組織特異性標志物信使RNA檢測來表明腫瘤細胞的存在。PCR 技術(shù)用于檢測基因的表達，所需樣品少、省時、經(jīng)濟，但也有其不足，如不能確定是否存在活的腫瘤細胞，外源基因污染、假基因干擾、RNA 的非法轉(zhuǎn)錄可致假陽性，而基因表達產(chǎn)物變異、取材的局限等可致假陰性。同時，RTPCR 的靈敏度極大程度上取決于所擴增的對象（即靶RNA） 的特異性，但目前絕大多數(shù)腫瘤細胞缺乏其特異性信使RNA ， 實驗操作上也有待于進一步標化。隨著新的腫瘤特異性標志物的發(fā)現(xiàn)，PCR反應條件的優(yōu)化，RTPCR有可能成為檢測腫瘤微轉(zhuǎn)移的常規(guī)方法。

　　3.5  免疫磁分離  新近建立的用于改進循環(huán)單個瘤細胞檢測的方法，采用FITC結(jié)合抗全細胞角蛋白單克隆抗體陽性細胞，與超順磁抗FITC微珠耦聯(lián)，然后進入高梯度磁場與免疫磁性活化細胞篩選機。富集的樣本準備作FCM、免疫熒光術(shù)、免疫細胞化學或RTPCR檢測［13，14］。Park 等［15，16］應用磁珠包被的抗CEA 單抗分離腫瘤患者外周血中瘤細胞，然后進行RTPCR ，并以常規(guī)RTPCR 作對照， 結(jié)果免疫磁珠RTPCR 和常規(guī)RTPCR 在1 ml外周血中檢出癌細胞的數(shù)量分別為101 和102 ，因此認為免疫磁珠RTPCR 診斷微轉(zhuǎn)移的敏感性和特異性優(yōu)于常規(guī)RTPCR.免疫磁分離可提高微轉(zhuǎn)移瘤細胞檢測的敏感性，從而減少假陽性和假陰性。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多因素、多階段、多步驟的復雜過程。因此對腫瘤微轉(zhuǎn)移的研究也是一項復雜的工程。通過對腫瘤微轉(zhuǎn)移機制的深入研究，可以尋找更科學、有效的腫瘤治療方案，以提高臨床治愈率，而微轉(zhuǎn)移的檢測無疑對建立個體化的治療方案具有重要作用。如果我們能在微轉(zhuǎn)移時得到明確診斷并給以針對性治療，可望將具有微轉(zhuǎn)移的瘤細胞扼殺在轉(zhuǎn)移形成的早期，讓治療發(fā)揮最大的功效，這對減少術(shù)后轉(zhuǎn)移和復發(fā)的形成，爭取良好的預后有重要作用。在對腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測中，針對不同類型的腫瘤、不同的標本，選取不同的檢測方法，同時對現(xiàn)有的檢測方法進行不斷改進與革新，并進一步研究新的檢測技術(shù)，我們相信，隨著對腫瘤微轉(zhuǎn)移機制和檢測方法的深入研究，在不久的將來，將會給腫瘤的診斷、治療帶來根本性的變化。

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