【摘要】目的研究流行性出血熱（EHF）腎組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和波形絲蛋白（vimentin）的表達(dá)及意義。方法應(yīng)用多重PAP免疫組化方法，對(duì)17例EHF尸檢腎組織中PCNA和vimentin的表達(dá)進(jìn)行觀察。結(jié)果EHF尸檢腎組織PCNA的陽性率為64.71％，集合管的增殖指數(shù)顯著大于遠(yuǎn)曲小管（P∨0.01），低血壓休克期患者遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞vimentin呈強(qiáng)陽性表達(dá)，相同部位PCNA也呈陽性，PCNA的陽性強(qiáng)度與局部病變的程度相一致。結(jié)論EHF患者急性腎功能衰竭的早就存在損傷腎小管上皮細(xì)胞的再生、增殖和分化，這些變化在EHF腎損傷的修復(fù)反應(yīng)中具有重要的意義。

　　流行性出血熱（EHF）累及腎臟時(shí)，可表現(xiàn)為不同程度的急性腎功能衰竭（ARF）。組織形態(tài)學(xué)及免疫組化研究表明，EHF腎損傷除腎髓質(zhì)出血外，主要表現(xiàn)為腎小管不同程度的變性、壞死和細(xì)胞骨架改變〔1，2〕。目前認(rèn)為，病毒的直接作用、免疫因素和炎性介質(zhì)的參與，以及低血壓休克共同作用所致腎小管上皮細(xì)胞損傷是ARF的主要原因，但對(duì)腎臟損傷后的修復(fù)過程卻了解甚少。我們以抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和抗波形絲蛋白（vimentin）的單克隆抗體（mAb），檢查了受損傷的腎組織中腎小管上皮細(xì)胞的增殖和分化，并探討了腎小管上皮細(xì)胞的再生在腎損傷后修復(fù)過程中的作用。

　　1.材料和方法

　　1.1　材料腎組織標(biāo)本取自17例EHF患者尸檢腎臟（由上海醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室提供），其中男14例，女3例，年齡20～58歲。臨床分期：低血壓休克期5例、少尿期11例、恢復(fù)期1例。所有病例既往均無急、慢性腎臟病病史，但均有不同程度的ARF，死后經(jīng)組織病理學(xué)和檢測(cè)病毒抗原而確診。正常對(duì)照組（5例）的標(biāo)本取自腎良性腫瘤旁的組織，經(jīng)HE染色后光鏡觀察，腎組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常。上述組織經(jīng)100mL/L福爾馬林固定、石蠟包埋，制成連續(xù)性切片（5μm）后待檢。免疫組化中所用一抗為抗PCNA（PC10，1∶100，DaKo公司產(chǎn)品）的mAb和抗波形絲蛋白（vimintinV9，1∶200，DaKo公司產(chǎn)品）的mAb。

　　1.2　方法

　　1.2.1　EHF腎組織的免疫組化染色采用多重PAP染色法〔3〕。主要步驟：組織切片脫蠟至水，以甲醇（800mL/L）H2O2（3.3mL/L）處理40min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，再以20mL/L正常羊血清37℃封閉1h.然后依次加抗PCNAmAb（1∶100）或抗vimentinmAb（1∶200，4℃孵育72h），羊抗鼠IgG（1∶300，本室制備）及鼠PAP（1∶10000，武漢生物制品所）進(jìn)行多重PAP染色。實(shí)驗(yàn)中以正常腎組織替代EHF患者的腎組織，以無關(guān)mAb或替代一抗及同一組織片作為自身對(duì)照。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　1.2.2　PCNA＋細(xì)胞核的定量采用了以下幾個(gè)指標(biāo)：①每個(gè)腎小球中PCNA的相對(duì)均值為所有腎小球中PCNA＋細(xì)胞總數(shù)除以腎小球個(gè)數(shù)。②分別計(jì)數(shù)腎小管不同部位PCNA＋的細(xì)胞，并隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野中PCNA＋的腎小管上皮細(xì)胞數(shù)。③增殖指數(shù)（PI）為平均每個(gè)高倍視野中PCNA＋的細(xì)胞數(shù)。所獲結(jié)果以━±s表示，組間均數(shù)的差異采用t檢驗(yàn)。

　　2.結(jié)果

　　2.1　EHF腎組織中PCNA的表達(dá)17例EHF患者的腎臟中，有11例PCNA呈陽性（64.71％）。各節(jié)段腎小管的PI值不盡相同（3.13～22.99）。PCNA＋細(xì)胞主要分布于遠(yuǎn)曲小管和集合管，但集合管的PI值顯著大于遠(yuǎn)曲小管（P∨0.01）。腎皮質(zhì)遠(yuǎn)曲小管也有不同程度的PCNA表達(dá)，定位于細(xì)胞核。腎小球中PCNA的相對(duì)平均值為1.63，與正常對(duì)照組無顯著差異（P∧0.05）。PCNA＋細(xì)胞不僅見于形態(tài)正常的腎小管，也見于“增生的集合管”（7/11例）。其中6例在PCNA表達(dá)的部位伴有不同程度的腎小管損傷、出血等病變。另外，部分病例的血管內(nèi)皮細(xì)胞（2/17）和間質(zhì)中，浸潤(rùn)的炎細(xì)胞PCNA的表達(dá)呈陽性。在低血壓休克期患者的腎臟中，可檢出PCNA的表達(dá)（4/5例），少尿期PCNA＋細(xì)胞數(shù)增多，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P∧0.05）。10例正常對(duì)照組的腎組織僅1例PCNA呈陽性，且PCNA＋細(xì)胞數(shù)極少。

　　2.2　EHF腎組織中vimentin的表達(dá)17例EHF患者的尸檢腎臟中，腎小球vimentin的表達(dá)同正常對(duì)照組；9例低血壓休克期患者腎臟的遠(yuǎn)曲小管及集合管上皮細(xì)胞vimentin的表達(dá)呈陽性，定位于胞漿近基膜處，外髓部位的集合管表達(dá)極弱。有6例患者的組織連續(xù)切片中，PCNA和vimentin表達(dá)于同一部位的集合管，且大多數(shù)集合管上皮細(xì)胞有變性壞死。表達(dá)vimentin的小血管有不同程度的擴(kuò)張和充血，尤以髓質(zhì)為甚并伴有出血。正常對(duì)照組的腎小球、大血管內(nèi)皮和平滑肌中vimentin呈均勻分布，但腎小管呈陰性。

　　2.3　病理形態(tài)學(xué)改變8例EHF患者的腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，并伴有系膜區(qū)增寬或輕度系膜細(xì)胞增生，3例有局灶、節(jié)段性腎小球纖維化。近曲小管上皮細(xì)胞有玻璃樣變性者3例、壞死者9例；髓質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生變性壞死者13例、腔內(nèi)有蛋白管型者8例、上皮細(xì)胞管型者9例、紅細(xì)胞管型者9例和鹽類結(jié)晶者6例。5例腎髓質(zhì)部位有灶性壞死，10例有腎小管再生的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，以集合管最明顯，偶見核分裂相。14例腎間質(zhì)有不同程度的水腫和血管擴(kuò)張、淤血，16例伴有彌漫性出血，9例有散在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)。

　　3.討論

　　PCNA是細(xì)胞DNA聚合酶的輔助蛋白，具有促進(jìn)DNA聚合酶δ延伸DNA鏈，及增強(qiáng)DNA聚合酶Ⅲ活性的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，在損傷細(xì)胞的DNA修復(fù)過程中，也表達(dá)PCNA〔4〕。Vimentin是一類中間絲蛋白，正常僅表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，是細(xì)胞早期增殖、分化的標(biāo)志之一。缺血后2～5d，vimenti3片段的表達(dá)增強(qiáng)，提示損傷部位有細(xì)胞的增殖反應(yīng)〔5〕。

　　本研究結(jié)果顯示，在EHF低血壓休克期病例的遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞vimentin呈強(qiáng)陽性表達(dá)，PCNA呈陽性，且后者表達(dá)的強(qiáng)度與局部病變的程度相一致，提示這些部位的上皮細(xì)胞存在DNA的損傷和修復(fù)。Vimentin＋的上皮細(xì)胞是確定腎臟修復(fù)的重要標(biāo)志。此外，PCNA的表達(dá)不僅出現(xiàn)于再生的小管細(xì)胞，在病變區(qū)內(nèi)形態(tài)正常的腎小管上皮細(xì)胞也呈陽性，而在近曲小管和腎小球中則較少出現(xiàn)陽性。

　　綜合以上表明，EHF患者的腎組織中存在著腎小管上皮細(xì)胞增生、分化的重要證據(jù)。腎小管上皮細(xì)胞vimentin和PCNA的表達(dá)，提示本病的早期就存在損傷腎小管的增生反應(yīng)；腎臟遠(yuǎn)曲小管既是損傷嚴(yán)重的部位，也是再生修復(fù)最活躍的部位，在EHF患者腎損傷的修復(fù)中具有重要的意義。

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