備考很痛苦，等考試完回頭看的時(shí)候你會(huì)感覺很幸福！關(guān)于檢驗(yàn)職稱的考試，相信很多朋友都想知道“酶免疫技術(shù)”的相關(guān)知識(shí)，為此醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)小編為大家整理了“酶免疫技術(shù)中酶和酶作用底物”相關(guān)內(nèi)容，希望對(duì)大家有所幫助，祝大家考試順利，取得好成績(jī)！

酶和酶作用底物

（一）酶的要求： 

一個(gè)酶蛋白分子每分鐘可催化10 3 ～10 4 個(gè)底物分子轉(zhuǎn)變成有色產(chǎn)物。用于標(biāo)記的酶應(yīng)符合：

1.酶的活性要強(qiáng)，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，純度高。

2.酶催化底物后產(chǎn)生的產(chǎn)物易于判斷或測(cè)量，方法簡(jiǎn)單易行、敏感和重復(fù)性好。

3.作用專一性強(qiáng) ，酶活性不受樣品中其他成分的影響，受檢組織或體液中不存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或抑制物。用于均相酶免疫測(cè)定的酶還要求當(dāng)抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合后，酶活性可出現(xiàn)抑制或激活。

4.易與抗體或抗原偶聯(lián) ，標(biāo)記后酶活性保持穩(wěn)定，且不影響 標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性 。

5.酶、輔助因子及其底物對(duì)人體無(wú)害 ，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物應(yīng)價(jià)廉易得。

（二）常用的酶

1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP）：

目前酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛 的標(biāo)記用酶。

由無(wú)色的糖蛋白(主酶)和亞鐵血紅蛋白(輔基)結(jié)合而成的復(fù)合物。

輔基是酶活性基團(tuán) ，而主酶則與酶活性無(wú)關(guān) ，HRP的純度用RZ(HRP分別在403nm和275nm處的吸光度比值)表示，RZ值應(yīng)大于3.0 。

RZ值僅說(shuō)明血紅素基團(tuán)在HRP中的含量 ，并非表示HRP制劑的真正純度，而且RZ值高的HRP并不意味著酶活性也高，RZ值與酶活性無(wú)關(guān) 。

酶活性以單位U表示： 即1分鐘將1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。酶變性后，RZ值不變但活性降低 ，因此使用酶制劑時(shí)，酶活性單位比RZ值更為重要。

2.堿性磷酸酶（AP）：

大腸桿菌來(lái)源 的AP分子量80kD，酶作用最適pH為8.0 ;小牛腸黏膜AP 分子量為100kD，最適pH為9.6 ;后一種AP的活性高 于前者。

3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：

β-Gal來(lái)源于大腸桿菌。因人血中缺乏此酶，以其制備的酶標(biāo)志物在測(cè)定時(shí)不易受到內(nèi)源性酶的干擾 ，從而提高特異性，被用于均相酶免疫測(cè)定 。

（三）常用的底物

1.HRP的底物

（1）鄰苯二胺（OPD）：

 是HRP最為敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下顯橙黃色 ，加強(qiáng)酸 如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)后呈棕黃色 ，最大吸收峰在492nm 波長(zhǎng)。OPD應(yīng)用液穩(wěn)定性差，易變色，需新配制后在1小時(shí) 內(nèi)使用，顯色反應(yīng)過(guò)程需避光 ，而且具有致癌 性。

（2）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：

 TMB經(jīng)HRP作用后變?yōu)樗{(lán)色，加入硫酸終止 反應(yīng)后變?yōu)辄S色 ，最大吸收峰波長(zhǎng)450nm。TMB穩(wěn)定性好，成色無(wú)需避光 ，無(wú)致突變作用，是目前ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物 。缺點(diǎn)是水溶性差 。

(3)其他：

5-氨基水楊酸(5-ASA)和2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)。

2.AP的底物

常用對(duì)-硝基苯磷酸酯（p-NPP） ，p-NPP經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色 對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405nm。

3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物

常用4-甲基傘酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光 物4-甲基傘形酮(4-MU)，其敏度性較HRP 高30～50倍，但測(cè)量時(shí)需用熒光計(jì)。

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