備考很痛苦，等考試完回頭看的時(shí)候你會(huì)感覺(jué)很幸福！關(guān)于檢驗(yàn)職稱的考試，相信很多朋友都想知道“紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)”的相關(guān)知識(shí)，為此醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)小編為大家整理了相關(guān)內(nèi)容，希望對(duì)大家有所幫助，祝大家考試順利，取得好成績(jī)！

1.待測(cè)菌株接種物制備

（1）通用情況：從過(guò)夜孵育的平板，優(yōu)先選擇哥倫比亞血瓊脂平板上的菌落上挑取數(shù)個(gè)單個(gè)菌落，直接接種4.5%生理鹽水制成菌懸液，使用比濁儀調(diào)整懸液的濁度使其達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠁挝?，使菌懸液中含有相?dāng)于ATCC 25922大腸埃希菌（1-2）*1012CFU/mL濃度。

（2）特殊情況：嗜血桿菌屬（本程序中所指的嗜血桿菌僅包括流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌）：從過(guò)夜孵育的HTM平板，直接接種4.5%生理鹽水制成菌懸液，使用比濁儀調(diào)整懸液的濁度使其達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠁挝?，使菌懸液中含有相?dāng)于ATCC 25922大腸埃希菌（1-2）*1012CFU/mL濃度。

2.接種平板

（1）調(diào)整好懸液的濁度后，用無(wú)菌棉簽浸入懸液內(nèi)，緊貼試管內(nèi)壁在液體上方旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，除去棉簽上多余的液體，但也應(yīng)適度。

（2）用拭子劃線整個(gè)瓊脂表面，從平板頂部到底部，均勻涂布，重復(fù)兩次此過(guò)程（一共三次）每次旋轉(zhuǎn)平板約60度，確保每次接種菌液均勻分布，最后在瓊脂平板的邊緣涂抹一圈，防止有流動(dòng)的菌懸液，并使菌液涂布于整塊平板的每個(gè)角落。

（3）涂布菌液完成的平板，可在室溫放置一會(huì)（3-5分鐘），以便在放置含有藥物的紙片前使瓊脂吸收表面多余的水分，但放置時(shí)間不應(yīng)超過(guò)15分鐘。

3.放置測(cè)試藥敏紙片

根據(jù)測(cè)試菌的不同，按照預(yù)先設(shè)定的分組，將抗菌藥物紙片貼于已接種細(xì)菌的瓊脂表面，每個(gè)紙片必須壓下以確保與瓊脂表面完全接觸無(wú)論是單獨(dú)放置的紙片或有紙片分配設(shè)備紙片必須分布均勻，兩紙片之間圓心的距離不少于24mm，紙片邊緣距離瓊脂邊緣不少于15mm。

使用的MH平板直徑為90mm，放置不超過(guò)5塊紙片。由于一些藥物幾乎是瞬間擴(kuò)散的，因此，一旦紙片與瓊脂表面接觸就不能再移動(dòng)位置，若位置不佳可在瓊脂的另一個(gè)位置重新放置一個(gè)紙片。

4.孵育

（1）通用情況：在放置好紙片后，15分鐘內(nèi)，將MH瓊脂倒置于號(hào)孵箱（35℃）中，孵育16～18小時(shí)（除外下面列出的需要延長(zhǎng)孵育時(shí)間的情況）。

嗜血桿菌屬、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌和鏈球菌KB紙片法測(cè)試平板應(yīng)放置于含有5% CO2的環(huán)境進(jìn)行孵育。

（2）延長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)：

①測(cè)試苯唑西林、頭孢西丁對(duì)葡萄球菌的敏感性時(shí)，孵育時(shí)間必須達(dá)到24h，才能滿足對(duì)結(jié)果判斷的要求。

②測(cè)試萬(wàn)古霉素對(duì)金黃色葡萄球菌及腸球菌屬的敏感性，孵育時(shí)間必須達(dá)到24小時(shí)。

5.抑菌環(huán)直徑測(cè)量

（1）通用情況：35℃，經(jīng)過(guò)16～18小時(shí)的孵育后，將貼有紙片的MH平板置于黑色不反光的背景上，采用游標(biāo)卡尺，來(lái)測(cè)量抑菌環(huán)的直徑（完全抑制區(qū)的直徑），可以從平板的背面，利用反射光，用肉眼觀測(cè)，讀取最接近的毫米數(shù)（讀取一個(gè)整數(shù)）。

沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的明顯的生長(zhǎng)的部位即是抑菌環(huán)的邊緣。一般情況下，在抑菌環(huán)邊緣出現(xiàn)只能在放大鏡下觀察到的微小菌落，可以忽略不計(jì)。

MH平板上的抑菌環(huán)呈均勻的圓形，測(cè)試菌株在平板上呈現(xiàn)融合生長(zhǎng)菌苔，若出現(xiàn)單個(gè)菌落稀疏生長(zhǎng)的情況，則說(shuō)明接種時(shí)調(diào)制的菌液濃度過(guò)稀，需要尋找可能的原因，并重新再一次進(jìn)行測(cè)試。

（2）特殊情況：

①苯唑西林對(duì)葡萄球菌的抑菌環(huán)：抬起平皿，對(duì)向光源，利用透射光觀察苯唑西林紙片周圍的抑菌環(huán)中是否有任何細(xì)微的菌落生長(zhǎng)，若是出現(xiàn)任何可以辨別的生長(zhǎng)，均應(yīng)判定苯唑西林耐藥。

②利奈唑胺對(duì)葡萄球菌的抑菌環(huán)：利用透射光，用游標(biāo)卡尺讀取抑菌環(huán)的數(shù)值。

③復(fù)方新諾明的抑菌環(huán)：MH平板中存在一定量葉酸抑制劑的拮抗劑，會(huì)導(dǎo)致測(cè)試菌輕微的生長(zhǎng)，因此，在測(cè)量復(fù)方新諾明的抑菌環(huán)直徑時(shí)應(yīng)當(dāng)忽略細(xì)微的生長(zhǎng)情況（約20%），而將明顯出現(xiàn)生長(zhǎng)的地方作為抑菌環(huán)的邊界進(jìn)行測(cè)量。

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