細(xì)胞染色原理是醫(yī)學(xué)檢驗技師考試所涉及的內(nèi)容，醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)提供醫(yī)學(xué)檢驗技師考試輔導(dǎo)資料，供廣大醫(yī)學(xué)檢驗技師考試考生參考學(xué)習(xí)。

細(xì)胞著色的原理至今雖無滿意的解釋，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是物理作用和化學(xué)作用綜合的結(jié)果。

1、物理作用

包括毛細(xì)管現(xiàn)象和滲透、吸收、吸附作用等。通過這些因素，染料的色素粒子就能順利地進(jìn)入組織、細(xì)胞并與其牢固結(jié)合而著色。

瑞氏染色法

Wrfeht和Giemsa都于1902年報告了各自的新的血液學(xué)染色劑，其主要特點是在制備多色性亞甲藍(lán)（主要指天青B）方面做了改進(jìn)，使血細(xì)胞和瘧原蟲著色較好，操作簡便。

上述染色法均是含伊紅和亞甲基藍(lán)衍生物的復(fù)合染料。在臨床檢驗工作中，瑞氏染色法常用于血液、其他體液、分泌物和排泄物涂片中各種細(xì)胞的染色，有利于在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及對細(xì)胞進(jìn)行分類檢查。

【染色原理】

瑞氏染色分兩相進(jìn)行，第一相是酸性染料伊紅與細(xì)胞中的堿性物質(zhì)如血紅蛋白、嗜酸性顆粒等結(jié)合；堿性染料天青B與細(xì)胞中的酸性物質(zhì)如核染色質(zhì)（chro－matin）、特異中性顆粒、血小板及富含核蛋白的胞質(zhì)結(jié)合。第二相是天青B和伊紅在適宜條件下形成紫色的天青B一伊紅復(fù)合物（azure B－eosin complex），這種復(fù)合物是形成Romanowsky－Giemsa效應(yīng)的基礎(chǔ)。

Romanowsky－Giemsa效應(yīng)包括：①白細(xì)胞核染色質(zhì)染成紫色，瘧原蟲的染色質(zhì)染成紅色；②中性粒細(xì)胞的顆粒及血小板顆粒區(qū)染成紫色；③產(chǎn)生本效應(yīng)必須有兩種染料參與，一種是天青B，另一種是伊紅。

Wittekind（1985）指出，天青B與DNA分子中的磷酸基結(jié)合，而伊紅既與DNA分子中的陽離子部位結(jié)合，又與天青B結(jié)合，與天青B的結(jié)合力來源于電子供一受體的電子轉(zhuǎn)移力，天青B的甲氨基（－NHCHs）與伊紅分子中的叛基（－COOH）間形成氫鍵。因此，天青B是噻嗪類染料中能與伊紅形成復(fù)合物的最佳選擇，因為擁有四個甲基側(cè)鏈的亞甲藍(lán)不能以氫鍵與伊紅結(jié)合。

甲醇除作為染料的溶劑，能將瑞氏染料解離成帶正電荷的天青B和帶負(fù)電荷伊紅外，因其具有脫水力，還可將細(xì)胞固定為一定形態(tài)，并使蛋白沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞與染料的接觸表面，增強(qiáng)染色效果。

細(xì)胞中的各種有機(jī)物質(zhì)（特別是蛋白質(zhì)）、染料等對環(huán)境的州值非常敏感。如環(huán)境偏酸，氫離子增多，降低對堿性染料的親和力；增強(qiáng)伊紅著色，出現(xiàn)異常紅染；相反，則可出現(xiàn)異常藍(lán)染。最佳環(huán)境應(yīng)維持在PH值6 4～6、8.因此，必須使用緩沖溶液。

【試劑】

1、Wright染液 瑞氏染粉0.1g；甲醇60.0ml.

將瑞氏染料放入清潔干燥乳缽里，加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，將已溶解的染料倒入棕色試劑瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料溶完，甲醇全部用完為止?；?qū)⑷鹗先痉酆图状贾苯又糜谧厣恐?，加碎玻璃適量，立即用力振蕩smin，置室溫中，連續(xù)3天，每天振搖2～3次，促其溶解。配好后放室溫，一周后即可使用。新配染液效果差，放置時間越長天青B越多，染色效果越好。久置應(yīng)密封，以免甲醇揮發(fā)或氧化成甲酸，甲醇需用AR級。上述量染液中也可加中性甘油3ml，除可防止染色中甲醇過早揮發(fā)外，并可使細(xì)胞著色清晰。

1、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.4～6.8）

磷酸二氫鉀（無水）0.3g；

磷酸氫二鈉（無水）0.2g；

蒸餾水加至1000ml.

配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。

【染色方法】

（1）用蠟筆在血膜兩頭劃線，然后將血片平放在染色架上；

（2）加瑞氏染液數(shù)滴，覆蓋整個血膜，固定細(xì)胞約lmin；

（3） 滴加等量或稍多的緩沖液，與染液充分混勻，染色5～10min；

（4）用清水沖去染液，待干后鏡檢。

【染色結(jié)果】在正常情況下，血膜外觀染成淡紫紅色。顯微鏡下，紅細(xì)胞呈粉紅色，在厚薄均勻處，略有碟狀感；白細(xì)胞漿中顆粒清楚，并顯示出各種細(xì)胞特有的色彩。細(xì)胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。

染色偏酸，則紅細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞顆粒偏紅，白細(xì)胞核呈淡藍(lán)色或不著色。染色偏堿，則所有細(xì)胞呈灰藍(lán)色，顆粒深暗。嗜酸性顆?？扇境砂岛稚?，甚至紫黑或藍(lán)色。中性顆粒偏粗、偏堿，染成紫黑色，血膜厚的部位呈綠色。

【注意事項】

1、未干透血膜的不能立即染色，否則染色時易脫落。

2、染色時間，與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)。梁液淡、室溫低、細(xì)胞多，則染色時間長；反之則可減少染色時間。染液濃淡及染色時間長短要摸索，特別是更換染液時更應(yīng)如此。

3、染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀，一旦染液沉淀在血膜上，則不易沖掉。

4、沖洗時不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖去，以防染料沉著在血膜上。沖洗染料時間不能過長，以防脫色。沖洗完的血片應(yīng)立放于架上，防止剩余水分浸泡脫色。

5、如血膜上有染料顆粒沉積，可用甲醇溶解，但需立即用水沖掉甲醇，以免脫色。

6、染色過談，可以復(fù)染，復(fù)架時應(yīng)先加緩沖液，創(chuàng)造良好染色環(huán)境，而后加染液，或加染液與緩沖液的混合液，不可先加染液。

7、染色過深可用水沖洗或浸泡一定時間，也可用甲醇脫色。

8、染色偏酸或偏堿時，均應(yīng)更換緩沖液再重染。