親和層析是利用生物大分子的生物學特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設計的層析技術。例如抗原和抗體、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結合成復合物。如果將復合物的一方固定在不溶性載體上，則可從溶液中專一地分離和提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能產(chǎn)生相當高的純化作用。另外，此法的優(yōu)點是迅速，有時僅一步即可達到純化的目的醫(yī)|學教育網(wǎng)搜集整理。

1.親和層析支持物的選擇作為親和層析支持物須符合以下要求：

①非特異性吸附低；

②液體通過時流速要快；

③在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；

④必須有合適的、豐富的化學基團，能有效地與蛋白質或其它化合物結合；

⑤必須帶有豐富的微孔，以增加結合容量。符合以上5個條件的支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。

2.配體的選擇 所謂配體系指具有親和性的雙方，作為免疫親和層析專指抗原與抗體。良好的配體必須具備以下3個條件。

（1）抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體的純化效果決定于固相中配體的純度。

（2）抗原與抗體之間必須有強的親和力：這種親和力決定于抗原決定簇的性質和數(shù)量。對抗體來說還決定于抗體來源動物的種類和免疫時間，如馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高；免疫時間短的親和力低。但是，親和力太強也不利，因為解離抗原抗體復合物所需要的條件就要強烈，從而可造成蛋白質的變性。例如用低pH（1.5～2.5）或高鹽（如6mol/L鹽酸胍）可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。

（3）配體必須有一個適當?shù)幕瘜W基團，這個基團不參與配體和大分子的特異結合，但可用來連接支持物，而且這種連接不應當影響配體與大分子結合的親和性。

3.抗原或抗體與支持物的結合 將抗原或抗體結合到支持物上的方法目前有20多種，但可歸結為載體結合法、物理吸附法、交聯(lián)法和網(wǎng)絡法4類。

結合法的一般步驟是先活化支持物上的功能基團，然后將抗原或抗體連接到這些活化的基團上。用來發(fā)生交聯(lián)的化學反應必須足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。交聯(lián)后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未交聯(lián)的物質。

最常用的支持物是Separose4B，將此支持物與溴化氰在pH11時進行處理，則能使支持物活化。此時溴化氰與支持物上的羥式反應形成氨基甲酸酯基團。加入溴化氰的量取決于支持物的量。如果希望取代程度提高，則加入溴化氰的量也要提高。交聯(lián)時首先要注意加入抗原或抗體的濃度。通常在交聯(lián)反應混合物中的交聯(lián)蛋白質濃度應是親和分離濃度的20～30倍。這樣，溴化氰濃度也必須提高到200mg/ml凝膠。若希望最終產(chǎn)物含量較少，所加入的溴化氰也應減少。交聯(lián)時的pH也應注意，pH9.5～10時，活化的瓊脂糖珠很不穩(wěn)定。降低pH，也就減少了能反應的配體濃度，交聯(lián)量就會減少。

親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯(lián)，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結合，產(chǎn)生了所謂的無效吸附。另外，Sepharose4B交聯(lián)時要求有一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯(lián)?；谶@兩個原因，通常在瓊脂糖與抗原之間接上不同長度的“手臂”。必要時這些“手臂”末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的配基偶聯(lián)。常用的帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖（二亞胺）、羧基瓊脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰瓊脂糖（0-溴乙酰-N－羧基琥珀酰胺）、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。這些帶“手臂”的瓊脂糖有商品供應，使用極為方便。

4.親和層析條件的選擇

（1）支持物與抗原或抗體結合后，還可能有多余的活性基團，為了封閉這些殘基團，必須用無關蛋白質或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團。

（2）去掉未結合及結合不牢固的蛋白質。先用0.2mol/LNaHCO2（含0.1mol/LNaC1，pH9.0）洗脫2～3個柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。

（3）解脫劑有多種。常用的有0.2mol/LpH2.8甘氨酸－HC1緩沖液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）、1mol/L乙酸、6mol/L鹽酸胍、0.2mol/LKC1等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）及0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液。