使基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，更好地為疾病的預(yù)防、診斷和治療服務(wù)，保證檢驗(yàn)質(zhì)量，特制定本規(guī)范。

　　一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其管理

　　臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置詳見《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文）附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。為避免污染，必須嚴(yán)格遵循《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。

　　臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室四個(gè)隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)（簡稱擴(kuò)增區(qū)）至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。

　　清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個(gè)主要原因，因此實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

　?。ㄒ唬┰噭┵A存和準(zhǔn)備區(qū)

　　下述操作在該區(qū)進(jìn)行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。

　　貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。

　　含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一次測定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來決定。

　　主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預(yù)試驗(yàn)來檢查，評價(jià)結(jié)果必須有書面報(bào)告。對于"熱啟動"技術(shù)（在第一個(gè)高溫變性步驟后加入酶），聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。

　　在整個(gè)本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。

　　嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。

　　工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈（254nm波長），在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺上60~90cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長照射時(shí)間，最好是照射過夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。

　　（二）標(biāo)本制備區(qū)

　　下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時(shí)cDNA的合成。

　　要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動?？赏ㄟ^在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。

　　用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒（例如含次氯酸鈉溶液）容器內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室桌椅表面每次工作后都要清潔，實(shí)驗(yàn)材料（原始血標(biāo)本、血清標(biāo)本、提取中的標(biāo)本與試劑的混合液等）如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。

　　對實(shí)驗(yàn)臺適當(dāng)?shù)淖贤庹丈洌?54nm波長，與工作臺面近距離）適合于滅活去污染?？梢苿幼贤饩€管燈可用來確保工作后對實(shí)驗(yàn)臺面的充分照射。

　　樣本處理對核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標(biāo)本檢測前對提取方法進(jìn)行評價(jià)。

　　用于RNA擴(kuò)增檢測樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因?yàn)閏DNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置一個(gè)以上的溫育裝置。

　　cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。

　　待測RNA的cDNA拷貝須保存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

　?。ㄈU(kuò)增區(qū)

　　下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣本制備區(qū)）的加入和主反應(yīng)混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

　　不能從本區(qū)再進(jìn)入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。

　　為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。如有加樣則應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。打開預(yù)處理過的反應(yīng)混合液時(shí)必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個(gè)簡單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。

　　完成操作及每天工作后都必須對實(shí)驗(yàn)室臺面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。

　?。ㄋ模U(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

　　下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測定。

　　核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法（同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記）、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法等。目前國內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。

　　本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。

　　由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

　　本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下（如安裝排風(fēng)扇）可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。

　　二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證

　　臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的所有階段，即測定分析前的標(biāo)本采集處理、測定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報(bào)告等。

　?。ㄒ唬?biāo)本的采集

　　常用于基因擴(kuò)增檢測的臨床標(biāo)本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時(shí)必須戴一次性手套。

　　玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因?yàn)椴Ａ髅蟪：胁灰资Щ畹腞NA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。

　　全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。

　　臨床用于RNA（如HCV RNA）擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時(shí)以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。

　?。ǘ?biāo)本的穩(wěn)定化處理

　　用于DNA擴(kuò)增檢測的標(biāo)本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。

　　由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標(biāo)本有時(shí)必須進(jìn)行穩(wěn)定化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場采樣。異硫氰酸胍鹽（Guanidine thiocyanate，GITC）可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1：4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清（漿）中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項(xiàng)目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測定方法來評價(jià)。

　?。ㄈ?biāo)本的運(yùn)送

　　標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過郵寄運(yùn)送。如用于DNA擴(kuò)增檢測的EDTA抗凝全血標(biāo)本及用于RNA擴(kuò)增檢測的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。通常在運(yùn)送時(shí)，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。

　?。ㄋ模?biāo)本的貯存

　　臨床體液標(biāo)本如血清/血漿等可于-70℃下長時(shí)間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液（pH 7.5-8.0）中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天。

　?。ㄎ澹?biāo)本的處理（核酸提取）

　　標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對其進(jìn)行充分評價(jià)以驗(yàn)證其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標(biāo)本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）或核酸提取過程中殘留的有機(jī)溶劑（如酚、氯仿等），這些物質(zhì)對其后的Taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測定。當(dāng)標(biāo)本為痰時(shí)，則必須先進(jìn)行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過長。此外，當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄PCR測定失敗的常見原因是標(biāo)本在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。對于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。

　?。┌泻怂岬哪孓D(zhuǎn)錄（RT）和擴(kuò)增

　　1、靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄

　　cDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的第一個(gè)酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補(bǔ)鏈，為后面擴(kuò)增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：（1）逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯(cuò)誤等；（2）用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物（如酚、氯仿、血紅素等）；（3）RNA酶的存在導(dǎo)致RNA的降解。

　　2、核酸的擴(kuò)增

　　有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測的假陽性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg²⁺濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。

　?。ㄆ撸┪廴?

　　在實(shí)際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴(kuò)增片段的污染（產(chǎn)物污染）；天然基因組DNA的污染、試劑污染（貯存液或工作液）以及標(biāo)本間交叉污染（如氣溶膠從一個(gè)陽性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本）。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中污染的最主要來源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。

　　由于一旦發(fā)生污染后，再圍繞實(shí)驗(yàn)室來尋找污染源不僅耗時(shí)而且還很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。但如果發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢。

　　1、測定分析前的污染源

　　測定分析前實(shí)驗(yàn)材料的污染主要來自非病人標(biāo)本來源的核酸。

　　2、測定分析階段的污染源

　　通常，測定分析階段的每一步都可能發(fā)生對樣本的污染。反應(yīng)混合液的任何成分及核酸的制備和反應(yīng)建立階段所涉及到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑（例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油）、商品酶制劑、消耗品（如反應(yīng)管，吸頭）和實(shí)驗(yàn)設(shè)備（如加樣器、離心機(jī)）等。

　　在前面三個(gè)工作區(qū)中，不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作會引起所使用的試劑、消耗品或?qū)嶒?yàn)設(shè)備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測時(shí)，非常容易引起污染，因此必須制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），并嚴(yán)格執(zhí)行。

　　3、污染的避免

　　要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防而不是排除污染，前面所述對工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的即是為了預(yù)防污染。

　　為避免以前測定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP，使得產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，這樣擴(kuò)增前在反應(yīng)混合液中加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），可破壞來自以前測定的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免其對以后要進(jìn)行的擴(kuò)增測定的污染。另外一種方法是持續(xù)的長波紫外燈照射，通過異補(bǔ)骨脂素光化學(xué)產(chǎn)生DNA加合物，由于DNA加合物對擴(kuò)增沒有反應(yīng)但又不妨礙PCR后雜交過程，所以這種方法也能防止污染。

　　上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其來替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴(kuò)增的天然DNA的污染。

　　4、去除污染的措施

　　工作完后必須定期對實(shí)驗(yàn)室采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法可達(dá)到最佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：（1）用10%（v/v）次氯酸鈉清潔表面；（2）試驗(yàn)后長時(shí)間的紫外照射實(shí)驗(yàn)操作臺面和其他表面；（3）實(shí)驗(yàn)設(shè)備如加樣器的高壓消毒。

　?。ò耍U(kuò)增產(chǎn)物的分析

　　擴(kuò)增產(chǎn)物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗(yàn)項(xiàng)目基本上都使用探針雜交方法。

　　雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適、標(biāo)記方法不對、對探針的標(biāo)記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。

　　最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉(zhuǎn)錄的反義RNA探針。探針的標(biāo)記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。

　　在擴(kuò)增后的雜交檢測中，應(yīng)該嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強(qiáng)度太高都會降低雜交的嚴(yán)格性，還會給檢測信號的特異性帶來負(fù)面影響。相反，提高溫度和/或降低離子強(qiáng)度會增加雜交的嚴(yán)格性。因此，嚴(yán)密控制溫度和試劑的離子強(qiáng)度是避免假陽性和假陰性結(jié)果的先決條件。要注意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時(shí)改變。

　?。ň牛┵|(zhì)量控制

　　質(zhì)量控制包括兩個(gè)方面，即室內(nèi)質(zhì)量控制（以下簡稱質(zhì)控）和室間質(zhì)量評價(jià)。

　　1、室內(nèi)質(zhì)量控制

　　必須對DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由于核酸擴(kuò)增測定的高敏感性，所以標(biāo)本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都要求有質(zhì)控措施。

　　（1）標(biāo)本制備：

　　常用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長度一般為~100kb，用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為30-40kb.明顯出現(xiàn)降解的DNA（在1和10kb的低分子量范圍內(nèi)）在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強(qiáng)的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶（如EcoRI）消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M(jìn)行質(zhì)控（在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切）。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計(jì)，質(zhì)量好的DNA提取物，A260/A280比值應(yīng)該在1.75~2.0之間否則，殘留的蛋白或酚可能會很高。僅用光度計(jì)比色方法不能對DNA的完整性下結(jié)論。

　　最快的對總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳，這一點(diǎn)跟DNA分離相同。但如果對結(jié)果有疑問，就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下，三種主要的核糖體RNA（28S、18S和5S）在凝膠上出現(xiàn)的帶相對較窄。如發(fā)生RNA的降解，則出現(xiàn)大量低分子量帶或出現(xiàn)帶的消失。測定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對RNA制備的質(zhì)量評價(jià)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標(biāo)。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨(dú)的光度計(jì)比色方法也不能對RNA的完整性下結(jié)論。

　　對于血清（漿）中病毒的測定，則要評價(jià)標(biāo)本出現(xiàn)溶血、脂血和黃膽情況下標(biāo)本處理方法對擴(kuò)增檢測的影響，避免由于標(biāo)本處理方法的不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，還可采用已知濃度標(biāo)本評價(jià)核酸提取方法的效果。

　　（2）逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增：本部份包括陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。

　　對逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增的質(zhì)控既可使用內(nèi)標(biāo)質(zhì)控方法也可采用外標(biāo)質(zhì)控方法。逆轉(zhuǎn)錄-擴(kuò)增檢測的內(nèi)標(biāo)通常為在整個(gè)細(xì)胞周期中均勻表達(dá)的mRNA，如HLA、β肌動蛋白和組蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外，也可在標(biāo)本制備時(shí)將外來內(nèi)標(biāo)加入到樣本中共同提取、逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。當(dāng)標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉(zhuǎn)錄酶失活，內(nèi)標(biāo)即會表現(xiàn)為陰性結(jié)果。

　　對于DNA測定內(nèi)標(biāo)可使用對有機(jī)體存活所必須的靶基因，如維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因。對于病原體的基因檢測，內(nèi)標(biāo)多采用人工制備的競爭性內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)可以監(jiān)控每一擴(kuò)增孔中假陰性的產(chǎn)生情況。

　　目前的商品試劑盒大部分沒采用內(nèi)標(biāo)方法質(zhì)控。因此在測定血清/血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時(shí)，應(yīng)使用已知的弱陽性血清/血漿作為質(zhì)控樣本，與待測臨床標(biāo)本等同處理提取核酸及擴(kuò)增，以判斷逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增檢測的效果。

　　使用這些外加弱陽性質(zhì)控不但可檢測擴(kuò)增反應(yīng)液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR試劑的檢測下限和特異性的信息。這些質(zhì)控樣本在擴(kuò)增檢測時(shí)必須使用與患者的標(biāo)本相同的主反應(yīng)混合液。

　　每一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)中都必須設(shè)有外加陰性質(zhì)控（污染監(jiān)測質(zhì)控），為判斷擴(kuò)增過程中污染出現(xiàn)的階段，陰性質(zhì)控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個(gè)過程中所帶的空白管、僅有擴(kuò)增反應(yīng)液但不含擴(kuò)增模板的反應(yīng)管、陰性標(biāo)本等。陰性標(biāo)本可以評估PCR實(shí)驗(yàn)的綜合質(zhì)量。

　　在擴(kuò)增靶RNA的RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，可做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴(kuò)增的DNA片段所引起的污染。

　?。?）板上雜交和膜上斑點(diǎn)印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點(diǎn)雜交時(shí)，陽性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標(biāo)本平行進(jìn)行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。

　?。?）測定結(jié)果的評價(jià)與報(bào)告：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，在判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)先對擴(kuò)增的熒光信號作出定性判斷，然后再進(jìn)行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結(jié)果分析的干擾。

　　結(jié)果的報(bào)告必須簡單清楚。定性測定報(bào)告"陽性"或"陰性"即可。定量測定則必須報(bào)告量的多少，如結(jié)果高于測定方法線性范圍上限，則對樣本稀釋后再測，結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)；如結(jié)果低于方法的測定范圍下限，則報(bào)？lt多少即可，不能報(bào)告為"0"或"陰性".

　　2、室間質(zhì)量評價(jià)

　　所有開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室都必須參加由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的全國臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的室間質(zhì)量評價(jià)，評價(jià)結(jié)果將作為其開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的依據(jù)之一。

　　本工作規(guī)范自公布之日起實(shí)施。