分子生物學技術概述--cDNA合成步驟是什么樣的？為了幫助大家了解，醫(yī)學教育網(wǎng)小編為您提供匯總：

1．cDNA第一鏈的合成

所有合成cDNA第一條鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應，主要有兩個關鍵因素，一個是mRNA模板，另一個是反轉錄酶 [3]  。商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒（AMV）逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒（MLV）反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括2個具有若干種酶活性的多肽亞基，這些活性包括依賴于RNA的DNA合成，依賴于DNA的DNA合成以及對DNA-RNA雜交體的RNA部分進行內切降解（RNA酶H活性）。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基，兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性，但降解DNA—RNA雜交體中的RNA的能力較弱。且其熱穩(wěn)定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的eDNA（如大于2——3kb）。AMV反轉錄酶和MI。V反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH、最適鹽濃度和最適溫度各不相同．所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要的。

AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3’端poly（A）結合的12——18個核苷酸長的oligo（dT）。

2．cDNA第二鏈的合成

cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種：

（1）自身引導法  。合成的單鏈eDNA3’端能夠形成一短的發(fā)夾結構，這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物。當?shù)谝绘満铣煞磻a(chǎn)物的DNA—RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段或反轉錄酶合成eDNA第二鏈，最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環(huán)，即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA5’端序列出現(xiàn)缺失和重排，因而該方法很少使用。

（2）置換合成法。該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產(chǎn)生的DNA RNA雜交鏈不用堿變性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。

從而產(chǎn)生一系列RNA引物，使之成為合成第二鏈的引物。在大腸桿菌DNA聚合酶工的作用下合成第二鏈。該反應有3個主要優(yōu)點：①非常有效；②直接利用第一鏈反應產(chǎn)物，無須進一步處理和純化；③不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。

3．cDNA合成技術

以Riboclone M-MLV CDNA合成技術為例。

Riboclone M—MLV cDNA合成系統(tǒng)采用M—MLV反轉錄酶的RNase H缺失突變株取代AMV反轉錄酶，使合成的cDNA更長。該系統(tǒng)的第一鏈合成使用M-MLV反轉錄酶，cDNA第二鏈合成采用置換合成法，采用RNaseH和DNA聚合酶I進行置換合成，最后用T4 DNA聚合酶切去單鏈末端，方法簡便易行。其基本步驟為先合成第一鏈：

（1）取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管，加入RNA模板和適當引物，每RNA使用0.5ug引物（如使用Not I引物接頭，用0.3ug），用H2O調整體積至15ul，70℃處理5min冷卻至室溫，離心使溶液集中在管底，再依次加入：

5X第一鏈緩沖液5ul。

RNasinRNA酶抑制劑25U

M—MLV（H）反轉錄酶200U

H2O調至總體積25ul

（2）用手指輕彈管壁，吸取5ul至另一eppendorf管，加入2——5ulCi[α一32P]dCTPdCTP（>400Ci/mmol），用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。

（3）37℃（隨機引物）或42℃（其他引物）保溫1h。

（4）取出置于冰上。

（5）摻入測定的eppendorf管加入95ul 50mM EDTA終止反應，并使總體積為100ul?？扇?0ul進行電泳分析（先用苯酚抽提）。另10ul進行同位素摻入放射性活性測定。

（6）第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成。

以上25ul反應總體積中所用RNA量為1ug，如合成5ugRNA，則可按比例擴大反應體積。倒5ugRNA使用125uL總體積進行合成。

第一鏈合成后再進行第二鏈合成：

（1）取第一鏈反應液20uL，再依次加入：

10X第二鏈緩沖液20uL

DNA聚合酶123ul。

RNaseH0.8ul

H2O加至終體積為100/uL

（2）輕輕混勻，如需進行第二鏈同位素摻入放射性活性測定，可取出10uL至另一eppendorf管，加入2——5uLCi[α一32P]dCTP。

（3）14℃溫浴2h（如需合成長于3kb的cDNA，則需延長至3——4h）。

（4）摻入測定eppendorf管中加入90ul 50mM EDTA，取10ul進行同位素摻入放射性測定．余下的可進行電泳分析。

（5）將cDNA第二鏈合成的反應液70℃處理10min，低速離心后置于冰上。

（6）加入2uL T4 DNA聚合酶，37℃溫育10min。

（7）加入10uL 200mmol/L EDTA終止反應。

（8）用等體積苯酚：氯仿抽提cDNA反應液，離心2min。

（9）水相移至另一eppendorf管，加入0.5倍體積的7.5mol/L醋酸銨（或0.1倍體積的1.5mol/L醋酸鈉，pH5.2），混勻后再加入2.5倍體積的冰冷乙醇（-20℃），-20℃放置30min后離心5min。

（10）小心丟去上清液，加入0.5mL冰冷的70%乙醇，離心2min。

（11）小心移去上清液，干燥沉淀。

（12）沉淀溶于10——20ul TE緩沖液。

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