輔助生殖技術(shù)--體外受精的程序是怎樣的？為了幫助大家了解，醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)小編為您提供匯總：

采集培養(yǎng)

1．卵母細(xì)胞的采集：卵母細(xì)胞的采集方法通常有三種。

⑴超數(shù)排卵：對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠、兔，以及家畜豬、羊等采用的主要方法是；用促性腺激素處理，使其排出更多的卵子，然后，從輸卵管中沖取成熟卵子可直接與獲能精子受精。在大家畜中，由于操作程序復(fù)雜，成本較高，很少使用。這種方法的關(guān)鍵是掌握卵子進(jìn)入輸卵管和卵子在輸卵管中維持受精能力的時(shí)間，一般要求在卵子具有旺盛受精力之前沖取。

⑵從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞 ：這種方法是借助超聲波探測(cè)儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡直接從活體動(dòng)物的卵巢中吸取卵母細(xì)胞。

在家畜中， 牛和馬等大家畜常用超聲波探測(cè)儀輔助取卵，其方法是用手從直腸把握卵巢，經(jīng)陰道壁穿刺插入吸卵針，借助B型超聲波圖像引導(dǎo)，吸取大卵泡中的卵母細(xì)胞。按照技術(shù)水平，一頭健康母牛每周可獲得5——10枚卵子。在家畜中，活體采集的卵母細(xì)胞一般要經(jīng)成熟培養(yǎng)后才能與精子受精。這種方法對(duì)擴(kuò)繁優(yōu)良母畜具有重大意義，在有些國(guó)家已用于商業(yè)化生產(chǎn)。

⑶從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞：這種方法是從剛屠宰母畜體內(nèi)摘出卵巢，經(jīng)洗滌、保溫（30℃——37℃）后，快速運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌條件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直徑卵泡中的卵母細(xì)胞（牛卵泡直徑要求3-10mm）也可對(duì)卵巢進(jìn)行切片，收集卵母細(xì)胞。用此方法獲得的卵母細(xì)胞多數(shù)處于生發(fā)泡期（GV期），需要在體外培養(yǎng)成熟后才能與精子受精。從廢棄卵巢中采集卵母細(xì)胞的關(guān)鍵是注意卵巢的保溫和防止細(xì)菌污染。因此卵巢從畜體摘取后須放入含有生理鹽水或磷酸緩沖液（PBS）的保溫瓶中；吸卵前卵巢要用生理鹽水或PBS多次洗滌；所用溶液都要添加抗生素。

這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是材料來(lái)源豐富，成本低廉，但確定母畜的系譜困難。

2．母細(xì)胞的選擇：采集的卵母細(xì)胞絕大部分與卵丘細(xì)胞形成卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complesx COC）。無(wú)論采用何種方法，采集的COC都要求卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，外圍有多層卵丘細(xì)胞緊密包圍。在家畜體外受精研究中，常把未成熟卵母細(xì)胞分為A、B、C和D四個(gè)等級(jí)。A級(jí)卵母細(xì)胞要求有三層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍，細(xì)胞質(zhì)均勻；B級(jí)要求卵母細(xì)胞質(zhì)均勻，卵丘細(xì)胞層低于三層或部分包圍卵母細(xì)胞；C級(jí)為沒(méi)有卵丘細(xì)胞包圍的裸露卵母細(xì)胞；D級(jí)是死亡或退化的卵母細(xì)胞。在體外受精實(shí)踐中，一般只培養(yǎng)A級(jí)和B級(jí)卵母細(xì)胞。

3．卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)：由超數(shù)排卵采集的卵母細(xì)胞已在體內(nèi)發(fā)育成熟，不需培養(yǎng)可直接與精子受精，對(duì)未成熟卵母細(xì)胞需要在體外培養(yǎng)成熟。培養(yǎng)時(shí)，先將采集的卵母細(xì)胞在實(shí)體顯微鏡經(jīng)過(guò)挑選和洗滌后，然后放入成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)。家畜卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培養(yǎng)法，微滴體積為50-200微升，每滴中放入的卵母細(xì)胞數(shù)按每5微升一個(gè)計(jì)算單位。卵母細(xì)胞移入小滴后，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39℃、100%濕度和5%二氧化碳的空氣。牛的培養(yǎng)時(shí)間為20-24小時(shí)，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體經(jīng)成熟培養(yǎng)后，卵丘細(xì)胞層擴(kuò)散靠近卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞呈放射狀排列，出現(xiàn)放射冠，用DNA特意性染料染色后，在顯微鏡下進(jìn)行核相觀察，可見(jiàn)卵母細(xì)胞處于第2次成熟分裂中期。

精子的采集

假陰道法

手握法

電刺激法

體外受精

1．精子的獲能處理：哺乳動(dòng)物精子的獲能方法有培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)兩種方法。牛、羊的精子常用化學(xué)藥物誘導(dǎo)獲能，誘導(dǎo)獲能的藥物常用肝素和鈣離子載體。

2．受精：即獲能精子與成熟卵子的共培養(yǎng)，除鈣離子載體誘導(dǎo)獲能外，精子和卵子一般在獲能液中完成受精過(guò)程。受精培養(yǎng)時(shí)間與獲能方法有關(guān)。在B2液中一般為6-8小時(shí)而用TALP或S.F液作受精液時(shí)可培養(yǎng)18——24h。精子和卵子常在小滴中共培養(yǎng)，受精時(shí)精子密度為1——9×10 6/ml，每10微升精液中放人1——2枚卵子，小滴體積一般為50——200微升。

胚胎培養(yǎng)

精子和卵子受精后，受精卵需移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育潛力，質(zhì)量較好的胚胎可移入受體母畜的生殖道內(nèi)繼續(xù)發(fā)育成熟或進(jìn)行冷凍保存。

提高受精卵發(fā)育率的關(guān)鍵因素是選擇理想的培養(yǎng)體系。在家畜中，胚胎培養(yǎng)液分為復(fù)雜的和化學(xué)成分明確的培養(yǎng)液兩大類。復(fù)雜培養(yǎng)液中的成分很多，除無(wú)機(jī)和有機(jī)鹽外，還添加維生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等營(yíng)養(yǎng)成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。用它們培養(yǎng)胚胎時(shí)，可以采用體細(xì)胞共培養(yǎng)體系，即體細(xì)胞與胚胎在微滴中共同培養(yǎng)，利用體細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的有益因子，促進(jìn)胚胎發(fā)育，克服發(fā)育阻斷。

受精卵的培養(yǎng)廣泛采用微滴法，胚胎與培養(yǎng)液的比例為一枚胚胎用3——10微升培養(yǎng)液；一般5——10枚胚胎放在一個(gè)小滴中培養(yǎng)以利用胚胎在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的活性因子，相互促進(jìn)發(fā)育。胚胎培養(yǎng)條件與卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)條件相同。有的實(shí)驗(yàn)室采用88% N2、7% O2和5%二氧化碳混合氣體培養(yǎng)，以降低培養(yǎng)液中氧自由基濃度，提高胚胎發(fā)育率。胚胎在培養(yǎng)過(guò)程中要求每48-72小時(shí)更換一次培養(yǎng)液，同時(shí)觀察胚胎的發(fā)育狀況。當(dāng)胚胎發(fā)育到一定階段時(shí)可進(jìn)行胚胎移植或冷凍保存，牛、羊受精卵通常培養(yǎng)到致密桑椹胚或囊胚時(shí)進(jìn)行移植或冷凍保存。

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