【摘要】  目的：觀察高原嚴重燒傷延遲復(fù)蘇后早期大鼠腦損傷及興奮性氨基酸含量的變化。 方法：130只雄性Wistar大鼠隨機分為燒傷即時復(fù)蘇組（n=60）、燒傷延遲復(fù)蘇組（n=50）和正常對照組（高原地區(qū)正常對照組n=10和蘭州地區(qū)正常對照組n=10）。 前兩組動物被制成高原（海拔3800 m）燒傷實驗動物模型（TBSA 30％，Ⅲ度）。 運用高效毛細管電泳法檢測腦組織中興奮性氨基酸（谷氨酸，Glu）含量，采用干、濕重比重法測定腦組織含水量，原位末端標(biāo)記（TUNEL）觀察腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡。 結(jié)果：從蘭州地區(qū)急進高原后，大鼠腦組織Glu含量、腦組織含水量、腦皮質(zhì)中TUNEL陽性細胞數(shù)均未發(fā)生明顯改變（P>0.05）；高原嚴重燒傷后腦組織Glu水平于傷后1 h即顯著降低，持續(xù)至傷后24 h，于傷后72 h恢復(fù)至正常水平（P<0.05）；延遲復(fù)蘇組腦組織Glu水平在觀察時限內(nèi)均低于上述兩正常對照組，延遲復(fù)蘇組與即時復(fù)蘇組相比除在傷后12 h時相點無統(tǒng)計學(xué)差異外，其余時相點均低于即時復(fù)蘇組（P<0.05）。 而腦組織含水量于傷后6 h開始升高，于24 h達高峰，于傷后7 d降至正常水平；高原燒傷延復(fù)組變化趨勢同高原燒傷即復(fù)組，但傷后7 d仍未恢復(fù)。 腦皮質(zhì)TUNEL陽性細胞在傷后1 h即增多，也于傷后24 h達高峰，傷后7 d仍高于正常水平。 結(jié)論：由蘭州地區(qū)急進到高原地區(qū)，并不足以導(dǎo)致大鼠腦組織中興奮性氨基酸含量發(fā)生變化及大鼠腦水腫的發(fā)生和腦皮質(zhì)凋亡細胞數(shù)的增加；高原嚴重燒傷及延遲復(fù)蘇后，細胞外興奮性氨基酸減少，同時伴有受傷大鼠迅速出現(xiàn)腦水腫，腦皮質(zhì)凋亡細胞顯著增加。

　　【關(guān)鍵詞】  燒傷；延遲復(fù)蘇；興奮性氨基酸類；腦水腫；細胞凋亡；大鼠

　　0引言

　　嚴重燒傷引起的腦損傷及腦水腫在平時和戰(zhàn)時均很常見，已有大量文獻報道［1-3］。 大量研究顯示興奮性氨基酸（excitatory amino acids， EAAs）的大量釋放而產(chǎn)生的毒性作用，在加重繼發(fā)性腦損傷中起重要作用。本研究利用大鼠嚴重燒傷后即時復(fù)蘇與延遲復(fù)蘇模型，初步觀察高原嚴重燒傷延遲復(fù)蘇后早期大鼠腦組織中興奮性氨基酸含量變化及與腦損傷的關(guān)系。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康雄性Wistar大鼠130只，體質(zhì)量（250±30）g（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院實驗動物科）；細胞凋亡原位檢測試劑盒（AP），去核酸酶的蛋白酶K（德國Roche）；TritonX100，牛血清白蛋白、2，4二硝基氟苯（美國Sigma）；Brij35（美國Amresco）；L谷氨酸（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；多聚賴氨酸（北京中山生物技術(shù)有限公司）；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；高效毛細管電泳儀（LP/ACE5000）（美國Beckman Coulter Co.）。

　　1.2方法

　　1.2.1動物模型及分組

　　致傷前1 wk，置室溫19~25℃。 實驗前24 h用電推推去背部被毛，單籠飼養(yǎng)。 實驗前12 h禁食、水。 用含10 g/L的戊巴比妥鈉ip注射麻醉（40 mg/kg）后，除正常對照組外，于大鼠背部建立30%Ⅲ度燙傷模型（病理證實）。 致傷條件為90℃，20 s. 正常對照組：模擬燙傷（37℃水浴，20 s）。 動物隨機分為4組：高原燒傷即時復(fù)蘇組（高傷即復(fù)，n=60），傷后立即腹腔注射等滲鹽水（按Parkland公式） 4 mL/kg；設(shè)立觀察與檢測時間點：1 h（PB1h），6 h（PB6h），12 h（PB12h），24 h（PB24h），72 h（PB72h），7 d（PB7d）；高原燒傷延遲復(fù)蘇組（高傷延復(fù)，n=50），傷后6 h開始補液；設(shè)立觀察與檢測時間點：PB6h，PB12h，PB24h，PB72h，PB7d；高原正常對照組（高正常，n=10），不補液。 蘭州地區(qū)正常對照組（蘭正常，n=10，海拔1517 m），不補液。

　　1.2.2取材和實驗

　　高傷即復(fù)組大鼠于傷后1，6，12，24，72 h，7 d 6個時相點，高傷延復(fù)組大鼠于傷后6，12，24，72 h，7 d 5個時相點分別取材，每個時相點各取10只動物，固定于實驗臺，于各時相點抽血后，將大鼠斷頭，迅速取腦，置0℃冰鹽水沖洗，去除血液、大血管等結(jié)締組織，吸干；用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗后，用雙面刀片于腦正中線將腦組織縱形剖開，將大腦左半球切取完整的薄片（約 0.5 cm）后置于40 g/L的中性甲醛混合固定液，放于4℃冰箱，用于光鏡檢查及免疫組織化學(xué)檢測。 將上述剩余腦組織大腦皮質(zhì)，用電子天平稱重后置于80℃烤箱36 h再稱重，利用組織干濕重比值，觀察腦組織含水量，以檢測腦水腫的變化。 將大腦右半球迅速放置于凍存管中置于液氮中保存，用于興奮性氨基酸的檢測。

　　谷氨酸含量采用高效毛細管電泳法［4］檢測腦組織中谷氨酸含量。 所得結(jié)果用μmol/g表示。 腦組織含水量采用干濕比重法測定［5］：腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%. 細胞凋亡實驗步驟按文獻［6］及說明書并稍作改進進行。 DAB顯色，顯微鏡下觀察，細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細胞，即凋亡細胞。

　　統(tǒng)計學(xué)處理：所得數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件對組間差異進行單因素方差分析及兩兩比較，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2結(jié)果

　　2.1谷氨酸濃度變化急進高原（高正常）后腦組織Glu水平較蘭正常組稍降低，但統(tǒng)計學(xué)無差異（P>0.05）；高原嚴重燒傷后，高傷即復(fù)組Glu水平于傷后1 h即顯著低于上述兩正常對照組，于傷后6 h開始回升，于12 h再次下降，傷后24 h又升高，傷后72 h恢復(fù)至正常水平（P<0.05）；高傷延復(fù)組腦組織Glu水平在觀察時限內(nèi)均低于上述兩正常對照組，高傷延復(fù)組與高傷即復(fù)組相比除在傷后12 h時相點無統(tǒng)計學(xué)差異外，其余時相點均低于高傷即復(fù)組（P<0.05， 圖1）。

　　2.2腦組織含水量變化蘭正常組腦組織含水量為60.28％。 與蘭正常相比，高正常組腦組織含水量略升高但無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 高原嚴重燒傷后，高傷即復(fù)組于傷后6 h腦組織含水量開始升高，傷后24 h達高峰，隨后下降，傷后7 d降至正常水平；高傷延復(fù)組變化趨勢同高傷即復(fù)組，也于傷后24 h達高峰，但傷后7 d仍高于上述兩正常對照組，且兩組間對應(yīng)時相點相差無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05， 圖2）。

　　2.3細胞凋亡蘭正常組腦皮質(zhì)中只檢測到很少的TUNEL陽性細胞（2個/高倍視野），高正常組腦皮質(zhì)中TUNEL陽性細胞數(shù)較蘭正常組稍增高（3.67個/高倍視野），但兩者無統(tǒng)計學(xué)差異；而高傷即復(fù)組腦皮質(zhì)在各時相點均檢測到的TUNEL陽性細胞較上述兩正常對照組明顯增多（P<0.01），隨著受傷時間的延長，標(biāo)本TUNEL陽性細胞逐漸增多，于傷后24 h達高峰（233.67個/高倍視野），此后TUNEL陽性細胞數(shù)則呈現(xiàn)下降趨勢，傷后7 d仍顯著高于上述兩正常對照組。 高傷延復(fù)組腦皮質(zhì)中TUNEL陽性細胞數(shù)變化趨勢基本與高傷即復(fù)組相同，于傷后6 h顯著升高，但于12 h有一個下降過程，隨后開始增加，也于24  h達峰值（216個/高倍視野，圖3）；但高傷即復(fù)組及高傷延復(fù)組在上述各時相點所檢測到的凋亡細胞數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。 TUNEL標(biāo)記陽性的細胞核被染成棕褐色，胞漿復(fù)染為淡藍色。

　　3討論

　　海拔3000 m，大多數(shù)人在靜息狀態(tài)下可出現(xiàn)不同程度的高原反應(yīng)，隨著海拔高度的增高，高原病的發(fā)病率逐漸增加［7］。 腦組織對氧的需求量高，對缺氧的耐受性差，是機體對缺氧最敏感的組織［8］。  腦缺血再灌注損傷的機制十分復(fù)雜，能量代謝、細胞內(nèi)鈣、細胞凋亡、興奮性氨基酸毒性、細胞因子、氧自由基（ROS）產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)等可能與再灌注損傷有關(guān)［9］。 本研究在高原海拔3800 m實地環(huán)境條件下研究高原大鼠嚴重燒傷延遲復(fù)蘇后腦組織興奮性氨基酸含量動態(tài)改變及與腦損傷的關(guān)系。

　　黎海濤等［10］報道犬嚴重燒傷早期即有腦水腫形成，傷后12 h已十分明確。 本研究結(jié)果顯示，由蘭州地區(qū)（1517 m）飼養(yǎng)的大鼠通過急進高原地區(qū)（3800 m），我們發(fā)現(xiàn)兩組腦組織含水量并無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），表明本組動物急進高原后并未直接導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生；但當(dāng)大鼠嚴重燒傷后，即高傷即復(fù)組腦組織含水量于傷后24 h達峰值，傷后72 h腦水含量開始下降，傷后7d恢復(fù)正常；高傷延復(fù)腦組織含水量變化趨勢基本與高傷即復(fù)組相似，但于傷后7 d，仍未恢復(fù)正常。

　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為神經(jīng)遞質(zhì)的游離氨基酸分2類，即抑制性遞質(zhì)（如甘氨酸，γ氨基丁酸）和興奮性遞質(zhì)，它們共同維持著正常的神經(jīng)生理活動。 近期研究顯示， Glu等興奮性氨基酸在缺血性神經(jīng)細胞損傷中起關(guān)鍵作用。 其主要作用表現(xiàn)在兩個方面：即缺氧缺血時細胞間隙EAA的堆積和EAA受體的過度激活［11］。 缺血時間愈長，腦間質(zhì)Glu與Asp的峰值濃度愈高，神經(jīng)病理學(xué)和神經(jīng)學(xué)損傷愈嚴重，這與EAAs毒性作用為濃度依賴性呈一致性［12］。 但本實驗研究卻發(fā)現(xiàn)，大鼠急進高原后，雖然存在急進高原后的低氧、低氣壓等環(huán)境影響因素，但高正常組腦組織中Glu水平較蘭正常組并未出現(xiàn)較大的變化，而且在嚴重燒傷后，大鼠腦組織中Glu含量較正常對照組（蘭正常，高正常）不升反降，特別是高傷延復(fù)組在所觀察時相點均低于正常對照組，與文獻報道一致［13］。 考慮其主要機制可能是神經(jīng)細胞與膠質(zhì)細胞的EAAs再攝取功能在再灌注后迅速恢復(fù)，提示EAAs在延遲性神經(jīng)細胞損傷的過程中的可能作用。 本組研究結(jié)果也顯示高原燒傷及延遲復(fù)蘇缺氧缺血后EAA的動態(tài)變化可能有著與平原燒傷不同的特點，其不同點有待于今后進一步研究。

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