【關(guān)鍵詞】  內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； 衣霉素； 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78； 凋亡促進(jìn)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白； 小鼠

　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum， ER）廣泛存在于真核細(xì)胞中，是蛋白質(zhì)合成、折疊、運(yùn)輸以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子儲存的主要場所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子紊亂和未折疊蛋白質(zhì)蓄積可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress， ERS），發(fā)生具有保護(hù)作用的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response， UPR）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激直接影響應(yīng)激細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸，如修復(fù)、損傷或凋亡。神經(jīng)系統(tǒng)許多疾病與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。最近的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號傳導(dǎo)途徑可能與阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）的發(fā)病有關(guān)。本研究觀察滋補(bǔ)脾陰方藥（Zibu Piyin Recipe， ZBPYR）含藥血清對由N糖鏈抑制劑衣霉素（tunicamycin， Tm）引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，以探討其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

　　1  材料與方法

　　1.1  實驗藥物  滋補(bǔ)脾陰方藥由清代吳澄《不居集》中資成湯加味而成，由紅參30 g，山藥15 g，茯苓15 g，白芍15 g，丹參12 g，白扁豆15 g，蓮肉20 g，石菖蒲10 g，遠(yuǎn)志10 g，檀香4.5 g，橘紅9 g，甘草9 g組成，均購自大連醫(yī)藥集團(tuán)藥材公司。中藥常規(guī)水煎，每毫升中藥液含生藥3.29 g，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　1.2  主要試劑和儀器  達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco‘s modified eagle’s medium， DMEM）和胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶和TRIReagent，Sigma公司產(chǎn)品；Tm，星形孢菌素（staurosporine， STS），日本W(wǎng)ako公司產(chǎn)品；細(xì)胞毒性檢測試劑盒，Roche公司產(chǎn)品；RNase OUT和Oligo （dt），Invitrogen公司產(chǎn)品。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，Thermo Forma公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；UV754紫外分光光度計，上海分析儀器總廠產(chǎn)品；溫度梯度PCR擴(kuò)增儀，Thermo Hybaid公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國BIOTEKTM公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，UVP公司產(chǎn)品。

　　1.3  中藥血清制備  取健康雄性SD大鼠（220～250 ｇ）12只，隨機(jī)分為對照組和ZBPYR組，每組6只。適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后，ZBPYR組給予滋補(bǔ)脾陰方藥灌胃，10 ml/kg體質(zhì)量，此劑量灌胃2次/d，連續(xù)3 d；對照組給予等體積生理鹽水灌胃。于末次給藥后1 h腹主動脈取血，靜置2 h，2 000 r/min，4 ℃離心15 min分離血清，離心半徑為16.1 cm，56 ℃，30 min滅活。0.22 μm濾膜過濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　1.4  Neuro2a細(xì)胞的培養(yǎng)  小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞Neuro2a細(xì)胞株由日本北海道大學(xué)藥學(xué)部野村靖幸教授惠贈。細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后加入培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞單層長滿后用終濃度為0.25%胰蛋白酶37 ℃條件下消化3 min，以1∶3傳代。培養(yǎng)液含90% DMEM、10%胎牛血清和1％雙抗。細(xì)胞長至第三代可以使用。

　　1.5  乳酸脫氫酶釋放試驗  Neuro2a細(xì)胞接種后分為對照組、10％空白血清組、5％ZBPYR組、10％ZBPYR組、15％ZBPYR組、Tm（5 μg/ml）組、10％空白血清＋Tm（5 μg/ml）組、5％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）組、10％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）組、15％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）組。細(xì)胞單層長至70％時按以上分組給予相應(yīng)刺激。刺激后細(xì)胞放入5％CO2、37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）釋放試驗檢測LDH泄漏率。LDH實驗步驟按試劑盒說明執(zhí)行。LDH泄漏率為細(xì)胞上清中LDH活性與細(xì)胞總的LDH活性比值。LDH活性測定用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測。另外Neuro2a細(xì)胞接種后分為對照組、STS（0.1 μmol/L）組、10％空白血清＋STS（0.1 μmol/L）組、15％ ZBPYR＋STS（0.1 μmol/L）組，待細(xì)胞單層長至70％時按以上分組給予相應(yīng)刺激。刺激后細(xì)胞放入5％ CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測LDH泄漏率。

　　1.6  逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)  實驗分組同前。細(xì)胞單層長至90％時按以上分組給予相應(yīng)刺激。細(xì)胞放入5％ CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h.總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。（1）收集細(xì)胞用TRIReagent提取總RNA.用紫外分光光度計測定A260/A280，計算RNA濃度。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μl.取2 μg總RNA，加二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate， DEPC）水至總體積為9 μl，加0.5 μl Oligo （dt） 1218引物混合后，置70 ℃變性10 min.然后加入下列成分：5×第一鏈緩沖液5.875 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、0.1 mol/L DTT 2 μl、RNase抑制劑0.5 μl和逆轉(zhuǎn)錄酶0.125 μl，混合使反應(yīng)總體系為20 μl.放入46 ℃反應(yīng)1.5 h，70 ℃變性15 min，冰上5 min后進(jìn)行擴(kuò)增。（3）PCR反應(yīng)。在0.2 ml PCR管中加入1.2  μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、sd H2O 9 μl、10 mmol/L dNTP 0.24 μl、10×PCR緩沖液1.2 μl、聚合酶0.12 μl、上游引物（20 μmol/L）0.12 μl、下游引物（20 μmol/L）0.12 μl，總反應(yīng)體系為12 μl.（4）PCR產(chǎn)物觀察。PCR產(chǎn)物經(jīng)40％丙烯酰胺凝膠電泳后，EB染色15 min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照及圖像分析，然后計算待測基因與內(nèi)標(biāo)磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase， GAPDH）吸光度的比值。PCR反應(yīng)擴(kuò)增參數(shù)如下：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78， GRP78），94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)22圈，72 ℃ 5 min；凋亡促進(jìn)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/EBP homologous protein， CHOP），94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)25圈，72 ℃ 5 min；GAPDH，94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)28圈，72 ℃ 5 min.引物序列見表1.

　　表1  引物序列（略）

　　Table 1  Sequence of the primers

　　1.7  統(tǒng)計學(xué)方法  每組實驗重復(fù)4次，圖像分析采用LabWorks 4.6專業(yè)圖像分析軟件。數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，兩組間差異比較采用t檢驗。

　　2  結(jié)果

　　2.1  LDH釋放試驗檢測ZBPYR含藥血清對Tm刺激Neuro2a后LDH泄漏率的影響  各濃度含藥血清和10%空白血清組與對照組相比，LDH泄漏率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明血清對Neuro2a細(xì)胞沒有毒性作用；Tm（5 μg/ml）組與對照組相比，LDH泄漏率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；10％空白血清預(yù)處理組LDH泄漏率與Tm組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而各濃度ZBPYR含藥血清預(yù)處理組與Tm組相比，LDH泄漏率下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。10％藥物血清預(yù)處理組與10％空白血清預(yù)處理組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1.

　　2.2  RTPCR方法觀察ZBPYR含藥血清對Tm刺激Neuro2a后GRP78 mRNA表達(dá)的影響  各濃度含藥血清和10%空白血清組與對照組相比，GRP78 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明血清對Neuro2a細(xì)胞GRP78 mRNA表達(dá)沒有影響；Tm（5 μg/ml）組與對照組相比，GRP78 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；而加入血清預(yù)處理1 h后再加入濃度為5 μg/ml Tm各組與Tm（5 μg/ml）組相比，GRP78 mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.05），其中ZBPYR含藥血清預(yù)處理組GRP78 mRNA表達(dá)較空白血清預(yù)處理組GRP78 mRNA表達(dá)下降更加明顯（P＜0.05）。見圖2.

　　2.3  RTPCR方法觀察ZBPYR含藥血清對Tm刺激Neuro2a后CHOP mRNA表達(dá)的影響  各濃度含藥血清組與對照組相比，CHOP mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明血清對Neuro2a細(xì)胞CHOP mRNA表達(dá)沒有影響；Tm（5 μg/ml）組與對照組相比，CHOP mRNA表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）；10％空白血清預(yù)處理組與Tm（5 μg/ml）組相比，CHOP mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而各濃度ZBPYR含藥血清預(yù)處理組CHOP mRNA表達(dá)與Tm（5 μg/ml）組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；10％藥物血清預(yù)處理組與10％空白血清預(yù)處理組相比，CHOP mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2.

　　圖1  LDH檢測Tm刺激細(xì)胞后各組細(xì)胞LDH泄漏率（略）

　　Figure 1  LDH leakage from each group treated by Tm

　　**P＜0.01， vs normal control group； △P＜0.05， △△P＜0.01， vs Tmtreated group； ▲P＜0.05， vs 10％ control serumtreated group （n=4 for each group）。

　　圖2  RTPCR法觀察Tm刺激各組細(xì)胞后GRP78和CHOP mRNA表達(dá)（略）

　　Figure 2  Expressions of GRP78 and CHOP mRNAs in different groups treated by Tm （RTPCR）

　　Results of RTPCR electrophoresis from each group and values of IOD from each group （n=4 for each group）。 *P＜0.05， vs normal control group； △P＜0.05， vs Tmtreated group； ▲P＜0.05， vs 10％ control serumtreated group.

　　2.4  LDH釋放試驗檢測STS刺激Neuro2a后LDH泄漏率的變化  STS 0.1 μmol/L組與對照組比，LDH泄漏率升高（P＜0.01）；而加入15％空白血清預(yù)處理組與STS組相比，LDH泄漏率下降（P＜0.05）；15％ ZBPYR含藥血清預(yù)處理組與STS組相比，LDH泄漏率下降（P＜0.01）；15％ ZBPYR含藥血清預(yù)處理組與15％空白血清預(yù)處理組相比LDH泄漏率下降更加明顯（P＜0.05）。見圖3.

　　圖3  LDH檢測STS刺激細(xì)胞后各組細(xì)胞LDH泄漏率（略）

　　Figure 3  LDH leakage from each group treated by STS

　　**P＜0.01， vs normal control group； △P＜0.05， △△P＜0.01， vs STStreated group； ▲P＜0.05， vs 15％ control serumtreated group （n=4 for each group）。

　　3  討論

　　ERS是細(xì)胞的一種應(yīng)激反應(yīng)過程，糖饑餓、鈣平衡紊亂、糖基化抑制和二硫鍵合成減少等情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微環(huán)境發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的折疊受到影響，導(dǎo)致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，由此引起一系列以分子伴侶和折疊酶表達(dá)上調(diào)為標(biāo)志的應(yīng)答反應(yīng)，稱為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response， UPR）。通過UPR細(xì)胞才能在應(yīng)激情況下存活。分子伴侶GRP78與凋亡促進(jìn)因子CHOP是ERS時表達(dá)增多的兩種分子，被看作是ERS的標(biāo)志，在ERS中起著不同的作用。其中GRP78能保護(hù)細(xì)胞，而CHOP則是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此通過藥物干預(yù)后研究它們的表達(dá)情況可以進(jìn)一步了解藥物對ERS的作用。AD是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，病理特征為淀粉樣蛋白的沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、tau蛋白異常磷酸化和區(qū)域選擇性神經(jīng)元死亡［1］。AD與基因突變有關(guān)，主要有編碼淀粉樣蛋白前體基因（amyloid protein precursor， APP）和早老素（presenilin， PS）基因，這些基因都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)。AD相關(guān)的早老素突變，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并且通過改變APP的蛋白水解加工作用而部分地增強(qiáng)對應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡的易損性。PS1突變通過細(xì)胞表面有活性的鈣離子流入的直接減少，不依賴APP，并間接地通過APP處理作用和淀粉樣肽的產(chǎn)生增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放來解除對神經(jīng)元鈣離子穩(wěn)態(tài)的控制。這種鈣離子穩(wěn)態(tài)的干擾將改變APP的加工，過量生成β淀粉樣蛋白142（amyloid βprotein 142， Aβ142），同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣失衡，激活鈣蛋白激酶，切割內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的caspase12，從而激活caspase12介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性凋亡路徑，最終形成AD的病理變化［2］。除了鈣離子失調(diào)，PS突變下調(diào)UPR并增強(qiáng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的易損性［3］。PS1突變還誘導(dǎo)了一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)的凋亡前因子CHOP的表達(dá)［4］。PS是γ分泌酶復(fù)合物的一部分，與β分泌酶一起，裂解APP產(chǎn)生Aβ，并且PS突變增加總Aβ和Aβ142的產(chǎn)生。Aβ能直接引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子釋放并且誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和神經(jīng)毒性［5］。因而，在AD中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是引發(fā)和調(diào)節(jié)神經(jīng)元死亡的一個主要事件。現(xiàn)有研究顯示在AD神經(jīng)元死亡中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑和線粒體損傷的凋亡途徑相互影響，起著調(diào)控凋亡級聯(lián)反應(yīng)的作用［6］。中醫(yī)認(rèn)為人體的生長、發(fā)育和衰老與“腎”密切相關(guān)?！澳I精虛衰”是衰老的主要原因。同時又認(rèn)為“脾胃為血氣陰陽之根蒂”，“脾胃既和，其人壽；脾胃不和，其人夭”，因此也重視奉養(yǎng)脾胃精氣在延年中的作用［7］。老年癡呆發(fā)病于老年期。老年期脾胃氣衰，飲食減少，脾虛則化源不足，腦髓失養(yǎng)，神機(jī)失調(diào)而發(fā)為本病。因此脾虛是老年性癡呆的基本病機(jī)，脾的功能衰退在老年性癡呆發(fā)病過程中起著主導(dǎo)作用，并貫穿于全過程［8］。脾的生理功能是脾之陰陽共同作用的結(jié)果。脾陰是指存在于脾臟的陰液（包括血、津液和水谷精微等）和脾的物質(zhì)形態(tài)及其滋潤濡養(yǎng)功能。由于脾與大腦關(guān)系密切，脾陰虧虛嚴(yán)重影響大腦的意識、學(xué)習(xí)、思維、記憶和情緒等功能，導(dǎo)致一系列與腦相關(guān)的精神意識病證如意識不清、學(xué)習(xí)記憶能力下降和情緒失常等。因此，滋補(bǔ)脾陰應(yīng)當(dāng)是防治老年癡呆的一個重要措施。滋補(bǔ)脾陰方藥由清代吳澄《不居集》中資成湯加味而成，以人參補(bǔ)脾益氣生津，山藥益胃補(bǔ)脾養(yǎng)陰，白芍養(yǎng)陰緩急，丹參活血養(yǎng)血益陰，茯苓健脾安神益智等，共奏健脾益陰之效。本組以往的研究顯示，滋補(bǔ)脾陰方藥能通過改善老齡大鼠腦細(xì)胞線粒體膜Na+K+ATP酶、Ca2+Mg2+ATP酶活性，調(diào)節(jié)膜磷脂代謝障礙和修飾膜的作用［9］，以及延緩興奮性氨基酸受體N甲基D門冬氨酸（NmethylDaspartic acid， NMDA）受體、γ氨基丁酸（gammaaminobutyric acid， GABA）受體染色陽性神經(jīng)元在衰老過程中喪失，同時抑制神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）的表達(dá)，起到神經(jīng)保護(hù)、延緩腦衰老的作用［10］。本實驗中Tm刺激Neuro2a細(xì)胞LDH釋放試驗結(jié)果表明，在加入滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清預(yù)保護(hù)后，可以明顯降低Tm刺激細(xì)胞后的LDH泄漏率，結(jié)合RTPCR觀察到滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清預(yù)處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78及CHOP mRNA的表達(dá)受到抑制，兩種實驗結(jié)果的同步性可以推斷滋補(bǔ)脾陰方藥具有抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。STS刺激Neuro2a細(xì)胞LDH釋放試驗結(jié)果表明，加入滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清預(yù)處理后，可以明顯降低STS刺激細(xì)胞后的LDH泄漏率（STS是線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)劑）。因而表明滋補(bǔ)脾陰方藥同時具有保護(hù)線粒體損傷的作用。以上的研究結(jié)果為滋補(bǔ)脾陰方藥應(yīng)用于臨床防治AD提供了依據(jù)。AD是一種常見的神經(jīng)退行性病變，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無有效的治療手段，對社會和人們的生活造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)有的研究表明，神經(jīng)元的凋亡在AD的發(fā)病過程中起著重要的作用。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑和線粒體損傷的凋亡途徑已被證明在AD的發(fā)病過程中起著協(xié)同作用。我們的實驗證明，滋補(bǔ)脾陰方藥對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑和線粒體損傷的凋亡途徑具有雙重作用，因而有助于AD的防治，加之中藥治療有著毒副作用低、經(jīng)濟(jì)實惠的優(yōu)點，更易于為人們所接受。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　1 Mattson MP. Pathways towards and away from Alzheimer‘s disease. Nature. 2004； 430（7000）： 631639.

　　2 Nakagawa T， Zhu H， Morishima N， et al. Caspase12 mediates endoplasmic reticulumspecific apoptosis and cytotoxicity by amyloidbeta. Nature. 2000； 403（6765）： 98103.

　　3 Yasuda Y， Kudo T， Katayama T， et al. FADlinked presenilin1 mutants impede translation regulation under ER stress. Biochem Biophys Res Commun. 2002； 296（2）： 313318.

　　4 Milhavet O， Martindale JL， Camandola S， et al. Involvement of Gadd153 in the pathogenic action of presenilin1 mutations. J Neurochem. 2002； 83（3）： 673681.

　　5 Suen KC， Lin KF， Elyaman W， et al. Reduction of calcium release from the endoplasmic reticulum could only provide partial neuroprotection against βamyloid peptide toxicity. J Neurochem. 2003； 87（6）： 14131426.

　　6 Takuma K， Yan SS， Stern DM， et al. Mitochondrial dysfunction， endoplasmic reticulum stress， and apoptosis in Alzheimer‘s disease. J Pharmacol Sci. 2005； 97（3）： 312316.

　　7 Li ZP， Zhao WK， Xu PC， et al. Effects of recipes for replenishing qi and activating blood on senescence related gene expressions in the liver of aging rats. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2005； 3（5）： 370373. Chinese with abstract in English.

　　黎志萍， 趙偉康， 徐品初， 等。 益氣活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響。 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報。 2005； 3（5）： 370373.

　　8 Zhao WY， Chen R. Applying treatment to senile dementia based on differentiation of spleen syndrome. Zhong Yi Yao Xue Kan. 2005； 23 （9）： 16651666. Chinese.

　　趙文研， 陳榮。 從脾論治老年性癡呆癥。 中醫(yī)藥學(xué)刊。 2005； 23（9）： 16651666.

　　9 Zhan LB， Xu F， Dong YK， et al. Effect of the prescription nourishing the Piyin （PNPY） on the brain mitochria menbrane ATPase activity of senile rats. Zhong Yao Yao Li Yu Lin Chuang. 2000； 16（1）： 2425. Chinese with abstract in English.

　　戰(zhàn)麗彬， 徐楓， 董玉寬， 等。 滋補(bǔ)脾陰方藥對老齡大鼠腦線粒體膜ATP酶活性的影響。 中藥藥理與臨床。 2000； 16（1）： 2425.

　　10 Qu MY， Zhan LB. Effects of nourishing Piyin Remede on learning and memory of aged rat. Zhong Yao Yao Li Yu Lin Chuang. 2002； 18（6）： 3235. Chinese with abstract in English.