【摘要】  研究慢性束縛應激大鼠（肝郁脾虛模型）的血漿代謝表型改變，開展中醫(yī)證候?qū)W的研究，試圖通過對慢性束縛應激大鼠代謝物組的共性分析和生物標記物的發(fā)現(xiàn)，尋找肝郁脾虛證候的生物學本質(zhì)，探討代謝組學在中醫(yī)證候?qū)W研究中的應用。方法：選用實驗用二級雄性SD大鼠24只，隨機分為4組：7 d正常對照組（A組）、21 d正常對照組（B組）、 7 d 模型組（C組）和21 d模型組（D組），每組6只。以慢性束縛方法制作應激大鼠模型。分別于第8天和第22天麻醉后心室取血，用Varian UnityInova 600 M超導傅立葉變化核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）波譜儀檢測。自由感應衰減信號經(jīng)過32 k傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維NMR譜圖。調(diào)用VNMR軟件中的程序?qū)?H譜按默認值，分別從4.5～0.5 ppm（弛豫時間編輯）以及6.0～0 ppm（擴散編輯），每段為 0.04 ppm ，進行分段積分，將積分數(shù)據(jù)歸一化后，以文本文件或Excel文件貯存，用于模式識別分析。將上述得到的數(shù)據(jù)文件利用Simca-P 10.0軟件包進行主成分分析。結(jié)果：大鼠血漿 1H NMR譜的主成分分析，各組動物代謝譜各不相同，與已知應激狀態(tài)下動物體內(nèi)代謝的調(diào)節(jié)過程及結(jié)果相一致。正常對照組與模型組相比較發(fā)現(xiàn)，醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和3.44 ppm的未知化合物的譜峰峰形改變較為明顯。這些發(fā)生改變的代謝物可以作為肝郁脾虛證的生物標志物做進一步的研究。結(jié)論：各組大鼠血漿 1H NMR代謝譜之間存在差異，而且可能從代謝組學分析中找出特異的標志性代謝產(chǎn)物，闡釋中醫(yī)證候的生物學本質(zhì)。代謝組學分析是一種有良好發(fā)展前景的中醫(yī)證候?qū)W研究方法。

　　【關(guān)鍵詞】  代謝組學

　　代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學之后新近發(fā)展起來的一門學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。它主要研究生物對外源性物質(zhì)所引起的病理生理反應，以及對遺傳變異的應答和內(nèi)源性代謝物的動態(tài)變化，通過對生物體液和組織中隨時間改變的代謝物進行檢測、確定、定量和分類，將這些代謝信息與病理生理過程中的生物學事件關(guān)聯(lián)起來，以監(jiān)測活細胞中的化學變化。本課題組用慢性束縛應激大鼠模型，以動物行為學評定和以方測證等方法確定該模型為肝郁脾虛證候模型，運用代謝組學技術(shù)開展中醫(yī)證候?qū)W的研究，試圖通過對中醫(yī)病證引起的代謝物的共性分析和生物標記物的發(fā)現(xiàn)，尋找中醫(yī)證候的生物學本質(zhì)，促進中醫(yī)辨證的科學化和定量化，將代謝組學技術(shù)和中醫(yī)藥學的研究結(jié)合起來，探索出中醫(yī)藥復雜理論體系研究的新方法與新途徑。

　　1 材料與方法

　　1.1 動物與分組 實驗用二級雄性SD大鼠 24只 ，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物研究中心，合格證號為SCXK-京2002-0003.適應性飼養(yǎng)3 d后隨機分為：7 d正常對照組（A組）、21 d正常對照組（B組）、7 d模型組（C組）和21 d模型組（D組）4組，每組各6只。動物每籠6只群養(yǎng)，飼養(yǎng)于普通級動物房，室內(nèi)溫度保持為（22±2）℃，相對濕度保持為30%～40%，各組大鼠喂常規(guī)飼料，自由進食飲水。

　　1.2 造模方法 以慢性束縛方法制作大鼠肝郁脾虛證模型，將大鼠束縛于特制的束縛架上（T型束縛臺：底座寬10 cm、長20 cm、厚2.8 cm，上端束縛臺長22 cm，最寬處6.6 cm，前端有固定頭部的小架和適合四肢放置的凹槽，上端束縛臺有3條可調(diào)的軟 帶，兩寬一窄，分別在頭頸部、胸腰和腰背固定）， 3 h/d ，C組連續(xù)7 d，D組連續(xù)21 d，隨機選取束縛時間點。整個束縛過程中動物在同一環(huán)境中，不予以進水和食物。正常對照組均散養(yǎng)于各自的飼養(yǎng)箱中3 h.

　　1.3 取材與處理［1，2］ 分別于第8天和第22天清晨8時，用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射進行深度麻醉，手術(shù)剪剖開胸腔，用注射器穿刺左心室取血漿，采集血漿后于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）測量前樣品準備：取出血漿，常溫解凍，用德國Ep-pendorf公司產(chǎn)5424型離心機離心（14 000 r/min， 10 min），取上清300 μl，添加0.1% 2，2，3，3，三甲基甲硅烷基丙酸｛3-（trimethylsiyl）［2，2，3，3-2H4］propionate， TSP｝重水溶液100 μl、200 μl D2O于 5 mm 樣品管中，混勻，于4 ℃冰箱保存，備用。

　　1.4 NMR數(shù)據(jù)采集 在軍事醫(yī)學科學院生物醫(yī)學分析中心核磁共振實驗室進行檢測，27 ℃條件下，在Varian UnityInova 600 M 超導傅立葉變化核磁共振波譜儀上調(diào)用弛豫時間編輯（Carr-Purcell-Meiboom-Gill， CPMG）和擴散編輯（longitudinal eddy-delay， LED）相關(guān)脈沖序列，采用預飽和方式抑制水峰，飽和時間為2 s，混合時間為0.15 s，譜寬8 000 Hz，采樣點數(shù)32 k，累加次數(shù)64次，預飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。自由感應衰減（free induction decay， FID）信號經(jīng)過32 k傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維NMR譜圖。以TSP為化學位移參考峰的位置，設(shè)為0 ppm.調(diào)用VNMR軟件中的程序?qū)?H 譜按默認值，分別從4.5～0.5 ppm（CPMG）以及6.0～0 ppm（LED），每段為0.04 ppm，進行分段積分。將積分數(shù)據(jù)歸一化之后，以文本文件或Excel文件貯存，用于模式識別分析。

　　1.5 主成分分析 將積分值進行中心化和比例換算，用SIMCA-P 10.0軟件包（瑞典， Umetrics AB， Umea）進行主成分分析（principal component analysis ， PCA），求出主成分（principal compo-nents， PC），利用PC對各組大鼠血清的代謝組分進行分析，必要時進行判別分析（partial least squares discriminate analysis， PLS-DS）。

　　2 結(jié)果

　　2.1 四組動物血清1H NMR圖譜 見圖1.

　　圖1 四組動物血清的典型1H NMR譜圖（略）

　　Figure 1 Serum spectra of 600-M Hz1H NMR in 4 groups

　　A： Group A （7 d normal control group）； B： Group B （21 d normal control group）； C： Group C （7 d stress group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　2.2 時點相同的正常對照組與模型組動物血清1H NMR譜模式識別分析 A、C兩組動物血清LED實驗1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見圖2.LED實驗表明：A、C兩組大致以t5軸分開，A組樣本中極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein， VLDL）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein， LDL）（0.87、0.91、0.95和0.99）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein， HDL）（0.83）、膽堿（ 3.23 和3.27）、N-乙酰糖蛋白（N-acetyl-glycopro-tein， NAC）NAC1（2.07）等化合物含量較高； C組長鏈脂肪酸（1.31、1.23、1.27、1.36和1.39）、NAC2（ 2.15 ）以及1.59 ppm處未知化合物含量較高。

　　B、D兩組動物血清LED實驗1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見圖3.B、D兩組樣本間沿t4軸方向基本分開。從因子載荷圖上看，B組樣本中LDL（0.87、0.91和1.27）以及化學位移在4～5左右的含氧脂肪酸、不飽和脂肪酸等化合物的含量較高；D組樣本中LDL含量不高，NAC1（2.07）、 NAC2（2.16）及化學位移在1～3之間的飽和脂肪酸含量較高。A、C兩組動物血清CPMG實驗1H NMR譜的波峰積分值的PLS-DA結(jié)果見圖4.CPMG實驗結(jié)果表明，A組和C組組內(nèi)樣本間個體差異較大，且點c5與其他點有明顯差異。在排除點c5的基礎(chǔ)上進行PLS-DS.從得分圖中可以看出，A、C兩組可被圖中所示虛線大致分開。從因子載荷圖中可以看出，A組樣本中乳酸（1.36、1.38、1.4、4.16和 4.12 ）、丙氨酸（1.44）、脂類化合物（0.92和1.36）、血糖（3～4）、NAC2（2.16）以及谷氨酸（2.4）含量較高；而C組樣本中NAC1（2.08）、小分子化合物（ 1.12 ）以及乙醇和1.2 ppm與3.4 ppm所代表的未知化合物含量較高。B和D組進行的CPMG實驗，PLS-DS和PCA兩組都未能分開。

　　2.3 不同時點的正常對照組組間和模型組組間的動物血清1H NMR譜模式識別分析 A、B兩組動物血清LED實驗1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見圖5.LED實驗表明：A、B兩組被圖中所示虛線較好地分開。因子載荷圖結(jié)合原始圖譜分析，A組樣本中VLDL和LDL（0.87、0.91、1.27、1.31和1.35）、膽堿（3.23、3.27）以及不飽和脂肪酸（ 1.99 、5.31和5.35）等化合物含量較高；B組僅化學位移在3～4之間的可能為含氧脂肪酸的化合物含量較高。C、D兩組動物血清LED實驗1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見圖6.C、D兩組分組趨勢明顯，但是點c6與本組其他樣本間有明顯不同。排除c6后仍進行PCA分析，得分圖中可看出，C、D兩組沿t1軸能較好地分開，因而t1軸方向表示組間差異；各組內(nèi)樣本沿t2軸方向散開，因而t2軸方向表示組內(nèi)差異。因子載荷圖結(jié)合原始譜圖分析，C組樣本中VLDL和LDL（0.87、0.91、1.27、1.31和1.35）、膽堿（3.23、3.27）以及不飽和脂肪酸（5.31、5.35）等化合物含量較高；而D組中僅化學位移在 3～4 之間的可能為含氧脂肪酸的化合物和NAC含量較高。A、B兩組動物血清CPMG實驗1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見圖7.CPMG實驗表明，A、B兩組樣本可被如圖所示虛線大致分開。從因子載荷圖中可以看出，A組樣本中乳酸（1.36）、蘇氨酸（1.32）、脂類化合物（0.92、0.96）、丙氨酸（1.52）、NAC1（2.08）、3-羥基丁酯（1.28）以及2～3之間的小分子化合物含量較高；而B組樣本中血糖（3～4）、谷氨酸（2.44）、醋酸（1.96）及1.48 ppm和 1.24 ppm 處所表示的未知化合物含量較高。

　　C、D兩組動物血清CPMG實驗1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見圖8.C、D兩組樣本沿t2軸顯示出一定的分組趨勢，但兩組內(nèi)樣本間差異太大，而且c5和d1兩樣本與其他樣本間有明顯不同。排除c5和d1后對剩余數(shù)據(jù)進行PCA分析，從得分圖中可看出，兩組樣本被圖中所示虛線分開。從因子載荷圖中可看出，C組樣本中脂類化合物（ 0.96 、0.89、0.92、1.32和1.36）、血糖（3～4）、NAC1（2.08）、NAC2（2.2），以及1.24 ppm和 3.4 ppm 處所表示的化合物含量較高；D組樣本中乳酸（1.4、 4.16 ）、醋酸（1.96）、膽堿（3.24）、 1.48 ppm 等處化合物含量較高。

　　2.4 對1H NMR圖譜及模式識別的進一步分析 各正常對照組圖中主成分積分值基本集中分布于橢圓形散點圖（95%置信區(qū)內(nèi)）的4個區(qū)域，各正常對照組間無明顯交叉和重疊。對其進一步分析發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，C、D兩組中醋酸（1.99、4.12、4.16）及3.44 ppm的未知化合物的譜峰相對積分面積明顯增高而乳酸（1.34）、酪氨酸（6.95、7.27）和LDL（0.87、0.9、0.95和0.99）的譜峰相對積分面積明顯下降。見圖1、2、3和4.

　　圖2 A、C兩組血清代謝組PCA分值（t［4］ vs t［5］）散點分布和因子載荷（p［4］ vs p［5］）圖（擴散編輯）（略）

　　Figure 2 PCA score （t［4］ vs t［5］） and loading （p［4］ vs p［5］） plots for groups A and C serum spectra （LED）

　　A： Group A （7 d normal control group）； C： Group C （7 d stress group）。

　　圖3 B、D兩組血清代謝組PCA分值（t［3］ vs t［4］）散點分布和因子載荷（p［3］ vs p［4］）圖（擴散編輯）（略）

　　Figure 3 PCA score （t［3］ vs t［4］） and loading （p［3］ vs p［4］） plots for groups B and D serum spectra （LED）

　　B： Group B （21 d normal control group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　圖4 A、C兩組血清代謝組PLS-DS分值（t［1］ vs t［2］）散點分布和因子載荷（w*c［1］ vs w*c［2］）圖（弛豫編輯）（略）

　　Figure 4 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （w*c［1］ vs w*c［2］） plots for groups A and C serum spectra （CPMG）

　　A： Group A （7 d normal control group）； C： Group C （7 d stress group）。

　　圖5 A、B兩組血清代謝組PCA分值（t［1］ vs t［2］）散點分布和因子載荷（p［1］ vs p［2］）圖（擴散編輯）（略）

　　Figure 5 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （p［1］ vs p［2］） plots for groups A and B serum spectra （LED）

　　A： Group A （7 d normal control group）； B： Group B （21 d normal control group）。

　　圖6 C、D兩組血清代謝組PCA分值（t［1］ vs t［2］）散點分布和因子載荷（p［1］ vs p［2］）圖（擴散編輯）（略）

　　Figure 6 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （p［1］ vs p［2］） plots for groups C and D serum spectra （LED）

　　C： Group C （7 d stress group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　圖7 A、B兩組血清代謝組PCA分值（t［2］ vs t［3］）散點分布和因子載荷（p［2］ vs p［3］）圖（弛豫編輯）（略）

　　Figure 7 PCA score （t［2］ vs t［3］） and loading （p［2］ vs p［3］） plots for groups A and B serum spectra （CPMG）

　　A： Group A （7 d normal control group）； B： Group B （21 d normal control group）。

　　圖8 C、D兩組血清代謝組PCA分值（t［1］ vs t［2］）散點分布和因子載荷（p［1］ vs p［2］）圖（弛豫編輯）（略）

　　Figure 8 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （p［1］ vs p［2］） plots for groups C and D serum spectra （CPMG）

　　C： Group C （7 d stress group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　3 討論

　　本課題組在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應激狀態(tài)下，中樞內(nèi)源性阿片肽及相關(guān)指標在海馬、皮層和邊緣系統(tǒng)出現(xiàn)異常變化，中藥三個復方（疏肝、健脾和補腎）對其變化均有不同程度的調(diào)整作用，而疏肝中藥對皮層和海馬的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于其他兩種復方，并顯示出多靶點和雙向調(diào)節(jié)作用。作用途徑其一是對模型大鼠行為學異常變化有恢復作用，其二是增強模型大鼠免疫功能，其三是增加模型大鼠下丘腦單胺遞質(zhì)等含量，增加模型大鼠海馬單胺遞質(zhì)含量與海馬腦啡肽與前強啡肽mRNA表達，增加模型大鼠中樞糖皮質(zhì)激素受體及相關(guān)mRNA表達，增加模型大鼠中樞神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量。研究發(fā)現(xiàn)，逍遙散對慢性應激狀態(tài)下中樞內(nèi)源性阿片肽有調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)位點位于下丘腦、邊緣系統(tǒng)和皮層，提出肝主疏泄在應激調(diào)節(jié)中起主導作用，從肝論治應激導致的氣血紊亂與補脾和補腎同等重要，肝主疏泄與應激的調(diào)節(jié)位點除下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)以外，還有海馬和皮層等邊緣系統(tǒng)；提出神經(jīng)營養(yǎng)因子和內(nèi)源性阿片肽通過對海馬的保護作用來影響下丘腦-垂體-靶腺軸，從而實現(xiàn)對機體免疫功能的調(diào)節(jié)，驗證慢性束縛應激大鼠為肝郁脾虛證模型。在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)地提出了肝主疏泄的現(xiàn)代生理學內(nèi)涵以及肝郁脾虛證的病理生理基礎(chǔ)［3～8］。本實驗運用代謝組學技術(shù)，從1H NMR圖譜及模式識別分析發(fā)現(xiàn)：（1）各正常對照組圖中主成分積分值基本集中分布于橢圓形散點圖（95%置信區(qū)內(nèi)）的4個區(qū)域，各正常對照組間無明顯交叉和重疊。表明正常組與模型組之間存在代謝產(chǎn)物譜的顯著差異。也就是說正常組與以慢性束縛方法制作的應激大鼠肝郁脾虛證模型組之間有著代謝產(chǎn)物的不同，說明血漿代謝組學分析能夠較好地反映證候之間的差異，代謝組學技術(shù)是開展中醫(yī)證候研究的好方法。（2）在1H NMR圖譜中可以發(fā)現(xiàn)醋酸、乳酸、酪氨酸、LDL和3.44 ppm的未知化合物的譜峰峰形改變較為明顯。這些發(fā)生改變的代謝物可以作為肝郁脾虛證的生物標志物做進一步的研究。（3）醋酸、乳酸、LDL、酪氨酸與三羧酸循環(huán)能量代謝、糖酵解及脂肪和蛋白質(zhì)代謝途徑密切相關(guān)，上述內(nèi)源性代謝物的改變提示動物能量代謝及脂肪、蛋白質(zhì)代謝功 能異常，這與已知的應激狀態(tài)動物體內(nèi)代謝的調(diào)節(jié)過程及結(jié)果相一致。分析這些內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的形成、轉(zhuǎn)移機制和過程，可提示肝郁脾虛證的發(fā)生發(fā)展的潛在原因，從而揭示其生物學本質(zhì)。中醫(yī)證候之間可能存在著非常明顯的代謝產(chǎn)物的不同，這種不同是基于不同證候存在著不同物質(zhì)代謝或其代謝網(wǎng)路的改變。中醫(yī)證候的生物學基礎(chǔ)可能用代謝組學技術(shù)來找出特異的標志性代謝產(chǎn)物，用生物信息學方法分析生物標志物的功能，并確定“中醫(yī)證候相關(guān)代謝譜”。

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