【關(guān)鍵詞】  黃芪多糖； 增殖； 分化； mRNA； 前脂肪細(xì)胞

　　近年來許多研究表明，黃芪及其主要成分黃芪多糖（Astragalus polysaccharides， APS）可以調(diào)節(jié)糖脂代謝，具有改善胰島素抵抗的作用，因此廣泛運(yùn)用于2型糖尿病、肥胖和代謝綜合征等代謝相關(guān)性疾病的防治［1~4］。在以往的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可增加脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝取和利用，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化［3］，為了進(jìn)一步探討其影響前脂肪細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制，本研究從影響脂肪細(xì)胞分化的兩個(gè)主要基因過氧化物體增殖劑活化受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ， PPARγ）和CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CAAT/enhancer binding protein α， C/EBPα）mRNA與蛋白質(zhì)水平，觀察了APS對(duì)其的影響。

　　1  材料與方法

　　1.1  藥物與試劑  3T3L1前脂肪細(xì)胞株， American Type Culture Collection（ATCC）產(chǎn)品；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco‘s modified eagle’s medium， DMEM）、特級(jí)新生小牛血清、胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、青霉素G鈉鹽、硫酸鏈霉素、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate， DEPC）和溴化乙啶，Amresco公司產(chǎn)品；APS由復(fù)旦大學(xué)內(nèi)分泌研究所提供；胰島素、地塞米松、異丁基3甲基黃嘌呤、二甲氧唑黃｛2，3bis（2methoxy4nitro5sulfophenyl）5 ［（phenylamino）carbonyl］2Htetrazolium hydroxide， XTT｝、牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）、酶標(biāo)二抗，Sigma公司產(chǎn)品；羅格列酮（rosiglitazone， ROS），浙江天馬醫(yī)藥化工有限公司產(chǎn)品；Trizol試劑，Invitrogen公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜，Whatman公司產(chǎn)品；PPARγ和C/EBPα抗體，Adipogen公司產(chǎn)品；Access Realtime PCR System，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；BIO RAD Icycler 5色熒光定量PCR儀、紫外凝膠攝像分析儀和圖像分析軟件，Sygene Gene Genius公司產(chǎn)品。

　　1.2  實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1  3T3L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化  將3T3L1前脂肪細(xì)胞用含10%小牛血清的高糖DMEM，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至融合2 d后，加含0.5 mmol/L異丁基3甲基黃嘌呤、0.25 μmol/L地塞米松、10 μg/ml胰島素和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)48 h，換以含10 μg/ml胰島素的培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h，隨后以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換1次培養(yǎng)液，誘導(dǎo)分化8～12 d的3T3L1細(xì)胞85%以上呈脂肪細(xì)胞表型，可用于實(shí)驗(yàn)。

　　1.2.2  XTT法檢測APS對(duì)3T3L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響  將3T3L1前脂肪細(xì)胞按照不同的細(xì)胞濃度接種于96孔板，通過XTT法測定570 nm波長的吸光度值（OD570值），建立“OD570值細(xì)胞數(shù)目”曲線。然后再按1.5×104/ml 3T3L1前脂肪細(xì)胞的濃度接種96孔板，每孔100 μl培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁后分別加不同濃度的APS（0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L）干預(yù)培養(yǎng)，通過XTT法分別檢測各組的OD570值，通過“OD570值細(xì)胞數(shù)目”曲線計(jì)算出加藥24、48和72 h時(shí)的細(xì)胞數(shù)目。

　　1.2.3  3T3L1前脂肪細(xì)胞分化的定量檢測  將3T3L1前脂肪細(xì)胞按上述方法誘導(dǎo)分化。設(shè)置空白對(duì)照組（normal control， CON組）、黃芪多糖干預(yù)組（APS組）及羅格列酮干預(yù)組（ROS組），在培養(yǎng)液中分別加入不同的干預(yù)藥物。APS為0.4 g/L，ROS為10 μmol/L，CON組加等體積生理鹽水。在加分化液同時(shí)加藥，藥物與培養(yǎng)液同步更換。分化第8天進(jìn)行油紅O染色，拍攝照片。異丙醇處理已染色的細(xì)胞，裂解細(xì)胞后通過酶標(biāo)儀對(duì)脂滴著色程度進(jìn)行比色，570 nm波長檢測OD值，定量分析細(xì)胞的分化程度。

　　1.2.4  APS對(duì)脂肪細(xì)胞PPARγ和C/EBPαmRNA表達(dá)的影響  在12孔培養(yǎng)板中，前脂肪細(xì)胞的分化培養(yǎng)和藥物干預(yù)分組同前，在分化第8天時(shí)棄培養(yǎng)上清，收集細(xì)胞備用，實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測PPARγ和C/EBPα mRNA的表達(dá)。參照Trizol Reagent試劑盒抽提取各組細(xì)胞總RNA，取1 μl RNA樣本加99 μl超純水，在紫外分光光度計(jì)上比色進(jìn)行RNA定量，用A260和A280的比值確定RNA的純度，所有RNA樣品A260/A280在1.7～1.9之間。PPARγ上游引物5‘GACCACTCGCATTCCTTT3’，下游引物5‘CCACAGACTCGGCACTCA3’，PCR產(chǎn)物266 bp；C/EBPα上游引物5‘GGAAAGAAACGACTGGGAGC3’，下游引物5‘CGACTAGACGCTATTGTGATT3’，PCR產(chǎn)物214 bp；GAPDH上游引物5‘AAGGTCGGAGTCAACGGATT3’，下游引物5‘CTGGAAGATGGTGATGGGATT3’，PCR產(chǎn)物222 bp.以上引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。RNA的反轉(zhuǎn)錄：以AMV第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.各樣本取1 μg的RNA，加OligodT 1.0 μl，再加DEPC水至體積為12 μl，置70 ℃ 5 min后，再加入5×RT buffer 4 μl、RNasin 1.0 μl、dNTP 2 μl后混勻，置37 ℃ 5 min后，再加入MMLV 1.0 μl，總體積為20 μl，置42 ℃ 60 min后，再置70 ℃ 10 min，冰上終止反應(yīng)，cDNA即合成。PCR反應(yīng)：5×RTPCR buffer 5.0 μl，250 mmol/L MgCl2 0.3 μl，10 mmol/L dNTP 0.75 μl，10 μmol/L引物1.0 μl，25×SYBR GreenⅠ 1.0 μl，103×Calibration 1.0 μl，5 U/μl HS ExTaq 酶0.25 μl，模板1.0 μl，DEPC H2O補(bǔ)足25 μl.擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，之后95 ℃ 20 s，60 ℃  20 s，擴(kuò)增75個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，使用Sequence Detection System 軟件分析PCR過程各檢測樣本的域值循環(huán)數(shù)（threshold cycle， CT）值，CT值隨模板濃度增大而減小，故熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示的CT值恰好和mRNA表達(dá)水平相反，通過2ΔCT計(jì)算，將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

　　1.2.5  APS對(duì)前脂肪細(xì)胞PPARγ和C/EBPα蛋白表達(dá)的影響  在6孔培養(yǎng)板中，前脂肪細(xì)胞的分化培養(yǎng)和藥物干預(yù)分組同前，在分化第8天收集細(xì)胞采用免疫印跡（Western blotting）法檢測PPARγ和C/EBPα蛋白表達(dá)。具體方法：棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入4 ℃預(yù)冷的PBS輕輕洗滌細(xì)胞兩次，再在每孔加入200 μl的細(xì)胞總蛋白抽提液，置冰上待細(xì)胞樣品完全破碎后，轉(zhuǎn)入Eppendorf管中，2 ℃ 13 000 r/min，高速離心20 min，取上清，然后加入同樣數(shù)量的樣品緩沖液備用。在紫外分光光度計(jì)下以A280波長測定標(biāo)準(zhǔn)和樣本蛋白的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品蛋白濃度。配制濃縮膠和分離膠，110 V恒壓電壓下SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳60 min，電泳完成后取出積層膠，以適量的轉(zhuǎn)移緩沖液室溫平衡凝膠30 min，然后再用轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)，在冷卻條件下100 V電轉(zhuǎn)120 min.轉(zhuǎn)印后蛋白質(zhì)的可逆染色，用抗體偶聯(lián)物進(jìn)行免疫檢測，依次加入一抗和二抗，洗膜，化學(xué)法發(fā)光底物顯跡，膠片進(jìn)行顯影，定影，沖洗膠片，圖像掃描并分析各條帶的光密度，分別計(jì)算PPARγ和C/EBPα與內(nèi)參βactin的比值。

　　1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組比較用方差分析，兩組比較用t檢驗(yàn)。

　　2  結(jié)果

　　2.1  APS對(duì)3T3L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響  APS濃度從0.025到0.8 g/L，在24、48和72 h各時(shí)間段對(duì)前脂肪細(xì)胞的生長表現(xiàn)為增殖趨勢(shì)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其中濃度為0.2、0.4、0.8 g/L時(shí)在藥物干預(yù)24、48、72 h時(shí)增加明顯，與CON組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05， P＜0.01）。見表1.

　　表1  APS對(duì)3T3L1前脂肪細(xì)胞增殖作用的量效關(guān)系（略）

　　Table 1  Doseeffects of APS on proliferation of 3T3L1 preadipocytes

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs normal control group.

　　2.2  APS對(duì)3T3L1脂肪細(xì)胞分化的影響  脂肪細(xì)胞油紅O染色后進(jìn)行OD值測定，APS組OD值明顯高于CON組（P＜0.05），低于ROS組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示APS能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，促進(jìn)細(xì)胞分化。見表2、圖1.

　　2.3  APS對(duì)脂肪細(xì)胞PPARγ和C/EBPα mRNA表達(dá)的影響  APS組PPARγ mRNA表達(dá)量明顯高于CON組，低于PPARγ激動(dòng)劑ROS組（P＜0.05）；和CON組相比，APS和ROS均能增加C/EBPα mRNA的表達(dá)，但兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3.

　　2.4  APS對(duì)脂肪細(xì)胞PPARγ和C/EBPα蛋白表達(dá)的影響  經(jīng)內(nèi)參βactin校正后的結(jié)果表明，0.4 g/L的APS使PPARγ和C/EBPα蛋白的表達(dá)分別增加1.46和1.70倍，ROS則分別使其表達(dá)增加1.32和1.89倍，與CON組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05， P＜0.01），APS和ROS組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2.

　　表2  APS對(duì)3T3L1前脂肪細(xì)胞分化的影響（略）

　　Table 2  Effects of APS on differentiation of 3T3L1 preadipocytes

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs normal control group

　　圖1  APS對(duì)3T3L1前脂肪細(xì)胞分化的影響（油紅O染色，×200）（略）

　　Figure 1  Effects of APS on differentiation of 3T3L1 preadipocytes （red O staining， ×200）

　　3T3L1 preadipocytes were treated with APS （0.4 g/L） and ROS （10 μmol/L） respectively during cell differentiation. Pictures were taken at the 8th day. Vacuolus in the pictures represented lipid droplet and the degree of differentiation. UDP： undifferentiated preadipocytes； CON： normal control group； APS： Astragalus polysaccharidestreated group； ROS： rosiglitazonetreated group.

　　表3  APS對(duì)3T3L1脂肪細(xì)胞PPARγ和C/EBPα mRNA 表達(dá)的影響（略）

　　Table 3  Effects of APS on PPARγ and C/EBPα mRNA expressions in 3T3L1 adipocytes

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs normal control group； △P<0.05， vs ROStreated group.

　　圖2  APS對(duì)3T3L1脂肪細(xì)胞PPARγ和C/EBPα蛋白表達(dá)的影響（略）

　　Figure 2  Effects of APS on expressions of PPARγ and C/EBPα proteins in 3T3L1 adipocytes

　　3T3L1 adipocytes were treated with APS （0.4 g/L） and ROS （10 μmol/L） respectively during cell differentiation. Cells were collected for immunoblotting at the 8th day. Each bar represents mean±standard error （SE） from three independent experiments. CON： normal control group； APS： Astragalus polysaccharidestreated group； ROS： rosiglitazonetreated group. *P＜0.05，**P＜0.01， vs normal control group.

　　3  討論

　　脂肪組織不僅是機(jī)體被動(dòng)的燃料貯存庫和組織器官充填料，而且是一個(gè)巨大的內(nèi)分泌系統(tǒng)，它分泌多種活性因子參與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)；脂肪細(xì)胞分化失?？梢鹬镜倪^多堆積，繼而導(dǎo)致脂肪細(xì)胞內(nèi)分泌功能失調(diào)而引起胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生［5， 6］。因此，近年來脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控及其與肥胖、胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制的關(guān)系一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。研究藥物對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響，對(duì)于早期防治與肥胖和胰島素抵抗密切相關(guān)的2型糖尿病、高血壓、血脂紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化等代謝相關(guān)性疾病及減輕其危害具有重要意義。PPAR屬激素核受體超家族成員，由不同基因編碼的3個(gè)亞型PPARα、PPARδ和PPARγ組成，其中PPARγ最具脂肪組織特異性，對(duì)脂肪細(xì)胞的分化起著重要作用。胰島素增敏劑噻唑烷二酮（thiazolidinedione， TZD）和15脫氧前列腺素J 2（15dPJ 2）分別是PPARγ的合成配體和天然配體，與之結(jié)合可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化成熟。C/EBP家族有C/EBPα、β、γ等成員，其中C/EBPα在脂肪細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵性作用，促進(jìn)PPARγ的高表達(dá)，保持分化細(xì)胞的表型。TZD類藥物ROS是目前治療胰島素抵抗的代表藥物，它能促進(jìn)PPARγ表達(dá)增加和脂肪細(xì)胞的分化，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，增加脂肪組織胰島素敏感性。但ROS最終使脂肪積聚增多，引起體重增加，而肥胖與胰島素抵抗具有高度相關(guān)性，造成了治療上的矛盾。因此，尋求既能改善胰島素抵抗又可不增加體脂和體重的藥物對(duì)于代謝性疾病的防治極具意義。我們?cè)谂R床觀察到代謝綜合征早期患者除超重、腹圍增加外，多表現(xiàn)為體胖、氣短、出汗多、乏力、腹脹滿，舌苔多為薄苔，伴有血糖、血脂的異常。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為這些改變屬于氣化功能障礙，其成因是在先天正氣虛（脾、肺、腎三臟氣虛）基礎(chǔ)上，后天飲食恣意放縱，多食肥甘，嗜臥少動(dòng)，使脾虛失運(yùn)，肺虛失布，肝郁氣滯，腎虛氣化失職，體能消耗明顯降低，營養(yǎng)過剩，機(jī)體不能很好利用和代謝這些營養(yǎng)物質(zhì)，蓄積于體內(nèi)，遂變?yōu)闈?、痰、濁，久則郁熱、濕滯、血瘀等相互集結(jié)，臨床出現(xiàn)高血糖、高血脂等一系列糖脂代謝異常，進(jìn)而成為心腦血管等疾病主要的危險(xiǎn)因子。針對(duì)這種氣虛為本、不運(yùn)不化的病理狀態(tài)，臨床采取攻補(bǔ)兼施的治則，在健脾益氣，協(xié)助恢復(fù)脾胃運(yùn)化功能的基礎(chǔ)上，采取或清郁熱，或祛痰濕，或除瘀血等法治療。中藥黃芪味甘性微溫，補(bǔ)益肺脾腎三臟之氣，可以推動(dòng)脾胃中焦樞機(jī)，助脾散精，使氣血津液等精微物質(zhì)得以正常布散運(yùn)化，是治療代謝綜合征氣虛的主藥。近年來，許多臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明，黃芪及其主要成分APS有改善胰島素抵抗和調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用，因此被廣泛運(yùn)用于2型糖尿病、高血壓、代謝綜合征等代謝相關(guān)性疾病的防治［1~4， 7］。在以往實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)APS可增加脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化［3］，為了進(jìn)一步探討其影響脂肪細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制，從影響脂肪細(xì)胞分化的兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子方面做了深入的探討。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明APS在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)脂肪細(xì)胞的生長表現(xiàn)為增殖趨勢(shì)，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；APS能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積聚，促進(jìn)細(xì)胞分化；能夠在mRNA及蛋白水平促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵因子PPARγ和C/EBPα mRNA的表達(dá)，表現(xiàn)出和TZD類藥物ROS類似的效應(yīng)，這可能是其改善胰島素敏感性的機(jī)制之一。然而PPARγ激動(dòng)劑ROS發(fā)揮作用是以對(duì)前脂肪細(xì)胞的募集、促分化及在細(xì)胞內(nèi)積聚更多脂質(zhì)為基礎(chǔ)的，故其有負(fù)面影響，常常會(huì)引起體脂的聚積而造成體重增加等副作用［8， 9］，黃芪多糖是否有這方面的影響，如何進(jìn)行防治等問題值得進(jìn)一步深入研究。

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