【摘要】  探討益氣化瘀中藥對(duì)糖尿病皮膚潰瘍氣虛血瘀證大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的影響。方法：72只清潔級(jí)雄性SD大鼠，除8只作正常對(duì)照組外，其他大鼠在背部全層皮膚缺損開(kāi)放性創(chuàng)面的基礎(chǔ)上加造氣虛血瘀證糖尿病模型后，隨機(jī)分為模型組、貝復(fù)濟(jì)組、益氣化瘀組、益氣組和化瘀組。應(yīng)用免疫組織化學(xué)、圖像分析等技術(shù)，觀察各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中HIF-1α和VEGF水平的變化。結(jié)果：模型組HIF-1α水平高于正常對(duì)照組（ P <0.01），VEGF濃度明顯低于正常對(duì)照組（ P <0.01）。各用藥組HIF-1α表達(dá)水平明顯低于模型組（ P <0.01），VEGF表達(dá)水平明顯高于模型組（ P <0.01）。益氣化瘀組HIF-1α表達(dá)水平明顯低于貝復(fù)濟(jì)組、益氣組和化瘀組（ P <0.05或 P <0.01），VEGF表達(dá)水平明顯高于貝復(fù)濟(jì)組（ P <0.01）。益氣組與化瘀組HIF-1α和VEGF的表達(dá)水平相似，它們與貝復(fù)濟(jì)組之間無(wú)明顯差異。結(jié)論：益氣化瘀中藥能明顯促進(jìn)糖尿病皮膚潰瘍氣虛血瘀證大鼠的創(chuàng)面愈合，其機(jī)制與下調(diào)HIF-1α水平、上調(diào)VEGF的表達(dá)水平和改善局部缺血缺氧狀態(tài)有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】  糖尿病

　　我們?cè)陂L(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，益氣化瘀中藥對(duì)糖尿病皮膚潰瘍有顯著的療效［1］。為進(jìn)一步探討益氣化瘀中藥促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制，開(kāi)展了以下研究。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 72只雄性SD大鼠，清潔級(jí)，2月齡，體質(zhì)量200～250 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。動(dòng)物合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第02-22-2號(hào)。

　　1.2 藥物 益氣化瘀方由生黃芪、太子參、桃仁和地龍組成，劑量比例為2.5∶2.5∶1∶1.大鼠給藥劑量為11.61 g/（kg.d），減壓濃縮至含生藥 2.5 g/ml； 拆方益氣方由生黃芪和太子參組成，劑量比例為1∶1，大鼠給藥劑量為6.75 g/（kg.d），減壓濃縮至含生藥1.5 g/ml；拆方化瘀方由桃仁和地龍組成，劑量比例為1∶1，大鼠給藥劑量為 4.86 g/（kg.d）， 減壓濃縮至含生藥1.0 g/ml.以上中藥均由上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院制劑室按水煎醇沉工藝制備，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）貝復(fù)濟(jì)，珠海東大生物制藥有限公司產(chǎn)品。批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字S10980077.

　　1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法（streptavidin-biotin per-oxidase method， S-P）試劑盒，美國(guó)Zymed公司產(chǎn)品；EnVision試劑（HRP/Rabbit）即用型，丹麥Da-ko公司產(chǎn)品；缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascu-lar endothelial growth factor， VEGF）一抗（兔抗鼠，分別1∶100、1∶50稀釋），美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品；生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體，Vector公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠抗體，北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

　　1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)和醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，上海申騰信息技術(shù)有限公司產(chǎn)品； 攝像機(jī)（型號(hào)：MV-CP410），Panasonic公司產(chǎn)品；顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；BH2數(shù)碼相機(jī)，Nikon公司產(chǎn)品。

　　1.5 糖尿病皮膚潰瘍氣虛血瘀證大鼠模型的建立 給大鼠喂飼高脂飼料（4%膽固醇，10%豬油， 0.2% 甲基硫氧嘧啶，0.5%膽酸鈉，85.3%基礎(chǔ)飼料）10 d后，以pH 4.6，0.1 mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液溶解鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ），配成1%溶液，以60 mg/kg的劑量連續(xù)腹腔內(nèi)注射STZ溶液2 d，72 h后動(dòng)物血糖濃度大于16.7 mmol/L及尿糖為（++++）時(shí)，即成糖尿病氣虛血瘀證大鼠模型。將大鼠用鹽酸氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉后，造模區(qū)（腰椎正中偏上）剪毛，用直徑 15 mm 的圖章標(biāo)記造模面積，在無(wú)菌條件下，沿脊椎方向用外科方法作兩條深達(dá)筋膜，直徑為1.5 cm的創(chuàng)面，造成全層皮膚缺損開(kāi)放性創(chuàng)面模型。加蓋兩層消毒干紗布，用膠布“豐”字形固定。造模后每只大鼠連續(xù)4 d后腿肌肉注射青霉素40萬(wàn)U［2～4］。

　　1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥方法 72 只大鼠先隨機(jī)抽取8只為正常對(duì)照組，創(chuàng)面制作方法同前；其余64只大鼠建立糖尿病皮膚潰瘍氣虛血瘀證模型，造模過(guò)程中，未成糖尿病模型的7只，死亡3只。 54只 大鼠成模后再隨機(jī)分為益氣化瘀組（10只）、益氣組（11只）、化瘀組（11只）、貝復(fù)濟(jì)組（11只）、模型組（11只）。各組于造模后次日開(kāi)始給藥，換藥前均以1/5 000呋喃西林溶液清潔創(chuàng)面。正常對(duì)照組及模型組外敷單層生理鹽水紗布，生理鹽水灌胃， 1次/d； 益氣化瘀組、益氣組、化瘀組外敷單層生理鹽水紗布，中藥灌胃，1次/d；貝復(fù)濟(jì)組外敷以貝復(fù)濟(jì)浸透紗布，按創(chuàng)面大小剪成小塊貼于創(chuàng)面上，然后均在創(chuàng)面上加蓋兩層消毒干紗布，用膠布“豐”字形固定，生理鹽水灌胃，1次/d.連續(xù)用藥7 d，停藥后次日，分別將動(dòng)物麻醉（氯胺酮）處死，取局部創(chuàng)面新生肉芽組織為所需實(shí)驗(yàn)樣品。

　　1.7 HIF-1α和VEGF的檢測(cè)

　　1.7.1 免疫組織化學(xué)S-P法 取各組大鼠創(chuàng)面新生肉芽組織，生理鹽水清洗后，10%甲醛溶液固定。每組隨機(jī)選取8個(gè)樣本，將已固定的各肉芽組織標(biāo)本分別常規(guī)脫水，浸蠟，包埋，連續(xù)切片。取4 μm石蠟切片，二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水。PBS洗滌3次，3 min/次；3% H2O2室溫20 min，PBS洗滌3次，3 min/次；將切片浸入0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中，微波Ⅲ檔（98 ℃）2次進(jìn)行抗原修復(fù)，10 min/次，取出后在室溫下自然冷卻；滴加10%正常血清封閉內(nèi)源性非特異性抗原，室溫 30 min； 滴加一抗（分別為上述抗體及相應(yīng)抗體稀釋度），4 ℃冰箱過(guò)夜；PBS洗滌3次，3 min/次；滴加生物素化羊抗兔IgG 1∶200，37 ℃ 30 min；PBS洗滌3次，3 min/次；Streptavidin-HRP 1∶200，37 ℃ 30 min；PBS洗滌3次，3 min/次；0.05% DAB+ 0.03% H 2O2顯色8～12 min，流水洗；蘇木素襯染，流水洗；吹干，常規(guī)樹(shù)脂封片。檢測(cè)以胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒者判定為陽(yáng)性細(xì)胞，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

　　1.7.2 圖像分析法 采用MV-CP410攝像機(jī)、IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，通過(guò)顯微鏡、圖像采集卡、數(shù)碼相機(jī)或CCD攝像機(jī)采集數(shù)字圖像，數(shù)字圖像為標(biāo)準(zhǔn)的BMP（位圖）文件格式；在100倍顯微鏡下，先點(diǎn)擊圖像微尺上的兩個(gè)點(diǎn)，再將它的實(shí)際微米數(shù)輸入計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算得到比例因子后存儲(chǔ) 備用；消除免疫組化圖像中的紫藍(lán)色背景；選擇陰性區(qū)域，處理后用藍(lán)色表示；選擇棕黃色或棕褐色陽(yáng)性區(qū)域，處理后用紅色表示；測(cè)定圖像中陽(yáng)性區(qū)域面積和陽(yáng)性比率以及光密度值；每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，求出3個(gè)視野的平均值，計(jì)算HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)水平。

　　1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，進(jìn)行 t 檢驗(yàn)或多個(gè)樣本單因素方差分析（ q 檢驗(yàn)）。

　　2 結(jié)果

　　模型組HIF-1α的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（ P <0.01），VEGF的表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組（ P <0.01）；除化瘀組，其他各用藥組VEGF的表達(dá)水平均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （ P < 0.01）；其他各用藥組HIF-1α的表達(dá)水平明顯低于模型組（ P <0.01）；益氣化瘀組HIF-1α的表達(dá)水平明顯低于貝復(fù)濟(jì)組、益氣組和化瘀組（ P <0.01或 P <0.05），VEGF的表達(dá)水平明顯高于貝復(fù)濟(jì)組（ P <0.01），益氣組和化瘀組HIF-1α和VEGF的表達(dá)水平與貝復(fù)濟(jì)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；益氣組同化瘀組HIF-1α和VEGF的表達(dá)水平相似。見(jiàn)圖1、圖2和表1.

　　圖1 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織HIF-1α表達(dá)（免疫組化S-P法， ×100）（略）

　　Figure 1 Expression of HIF-1α in granulation tissue on skin ulcer wound in rats （immunohistochemical S-P method， ×100）

　　A： Normal control group； B： Untreated group； C： bFGF-treated group； D： Yiqi Huayu Recipe-treated group； E： Yiqi Recipe-treated group； F： Huayu Recipe-treated group.

　　圖2 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織VEGF表達(dá)（免疫組化S-P法， ×100）（略）

　　Figure 2 Expression of VEGF in granulation tissue on skin ulcer wound in rats （immunohistochemical S-P method， ×100）

　　A： Normal control group； B： Untreated group； C： bFGF-treated group； D： Yiqi Huayu Recipe-treated group； E： Yiqi Recipe-treated group； F： Huayu Recipe-treated group.

　　表1 創(chuàng)面肉芽組織HIF-1α和VEGF表達(dá)（略）

　　Table 1 Expressions of HIF-1α and VEGF in granulation tissue on skin ulcer wound in rats

　　**P <0.01， vs normal control group；△P <0.05，△△P <0.01， vs bFGF-treated group；▲▲P <0.01， vs untreated group；□□P < 0.01， vs Yiqi Huayu Recipe-treated group.

　　3 討論

　　糖尿病皮膚潰瘍的發(fā)生、發(fā)展、變化是“因虛感邪，邪氣致瘀，瘀阻傷正，化腐致?lián)p”的過(guò)程，其中“瘀”是在“虛”和“邪”的共同作用下產(chǎn)生，“邪”是在“虛”的基礎(chǔ)上外侵。因而“虛”、“瘀”是糖尿病患者創(chuàng)面難以愈合的關(guān)鍵。所謂虛即全身營(yíng)養(yǎng)不良，血液灌注不足，供血供氧不良，瘀即創(chuàng)面微循環(huán)的障礙。只有氣血足、瘀滯祛除，才能斷生腐之源，方能生肌長(zhǎng)皮。據(jù)此，唐漢鈞教授主張“祛瘀生新”，提出“祛瘀生肌”、“補(bǔ)虛生肌”理論。益氣化瘀中藥是由多年臨床實(shí)踐總結(jié)而成的，以生黃芪、太子參健脾益氣，使氣血充足，瘀毒移深就淺；桃仁、地龍養(yǎng)血和營(yíng)通絡(luò)，使血?dú)馔ɡ?，脈絡(luò)暢通，推陳致新，符合糖尿病皮膚潰瘍以“虛”、“瘀”為多見(jiàn)的臨床特征，在臨床已 取得了顯著效果［1］。研究表明，糖尿病皮膚潰瘍的發(fā)生、發(fā)展，主要是糖尿病患者高血糖、高血脂、高凝及高黏狀態(tài)等引起的血管病變、神經(jīng)病變、并發(fā)感染等多種因素共同作用的結(jié)果。血管病變導(dǎo)致血液循環(huán)障礙，局部組織呈慢性缺血、缺氧狀態(tài)，直接影響潰瘍愈合的程度及其預(yù)后，并且由于局部組織的缺血、缺氧，易于并發(fā)感染，導(dǎo)致潰瘍發(fā)生且難以愈合［5，6］。缺血缺氧的病理環(huán)境可誘導(dǎo)HIF-1的產(chǎn)生。HIF-1是一種DNA結(jié)合性蛋白質(zhì)分子，是由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位構(gòu)成的異源二聚體。HIF-1α須與HIF-1β在核內(nèi)合成二聚體才有活性［7］，HIF-1α通過(guò)與靶基因的DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合作用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，在上游水平調(diào)控30多種靶基因，如調(diào)控VEGF、內(nèi)皮素-1、誘導(dǎo)型NO合酶、促紅細(xì)胞生成素等的表達(dá)，從而促進(jìn)新生血管的形成和血管重構(gòu)，調(diào)節(jié)血管張力和改善血管通透性，增強(qiáng)糖酵解及血氧容量，使機(jī)體組織對(duì)缺血缺氧產(chǎn)生耐受與適應(yīng)［8～13］，從而啟動(dòng)創(chuàng)面修復(fù)機(jī)制。此外，受HIF-1調(diào)節(jié)的VEGF是影響血管新生的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子之一［10］，是一種作用最強(qiáng)，且唯一特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的促進(jìn)血管生成因子，它既可提高血管通透性，又可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激其分裂增殖，誘導(dǎo)新生血管生成并影響微血管的量，從而促進(jìn)創(chuàng)面的生長(zhǎng)愈合。本研究結(jié)果表明，益氣中藥、化瘀中藥均能在一定程度上改善局部的缺氧缺血狀態(tài)，且兩者無(wú)明顯差異，印證了中醫(yī)學(xué)“氣能行血”的思想及我們提出的“益氣助養(yǎng)肌生，化瘀利于肌生”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。而益氣中藥和化瘀中藥合用，其作用尤為顯著，印證了中醫(yī)學(xué)“氣血”理論，體現(xiàn)了中醫(yī)相須配伍的科學(xué)性，是臨床取得療效的關(guān)鍵所在，也體現(xiàn)中醫(yī)辨證論治的精華?？傊鏆饣鲋兴幙赏ㄟ^(guò)下調(diào)HIF-1的表達(dá)水平、上調(diào)VEGF的表達(dá)水平，改善局部缺血缺氧狀態(tài)，促使血管新生，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

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