【關(guān)鍵詞】  胃癌； 血清； 腫瘤； 大鼠

　　益氣消積方（Yiqi Xiaoji Recipe， YQXJR）是根據(jù)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院瑞金醫(yī)院中醫(yī)科主任沈小珩教授十多年致力于腫瘤研究的臨床經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合臨床實(shí)踐總結(jié)而出的新一代抗癌復(fù)方，臨床觀察對(duì)胃癌有較好的治療作用。本次實(shí)驗(yàn)采用益氣消積方含藥血清，溫育體外培養(yǎng)的人胃癌NKN28細(xì)胞，通過(guò)甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制作用，研究該方對(duì)體外培養(yǎng)的人胃癌NKN28細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

　　1  材料與方法

　　1.1  實(shí)驗(yàn)材料  SD大鼠50只，雄性，清潔級(jí)動(dòng)物，體質(zhì)量（250±30）g，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院瑞金醫(yī)院動(dòng)物房提供；人胃癌高分化腺癌細(xì)胞系NKN28細(xì)胞，由上海瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)孵育提供；益氣消積方主要由黃芪、全蝎和白花蛇舌草等組成，生藥購(gòu)自上海瑞金醫(yī)院中藥房，由中藥房代煎，上海中藥研究所實(shí)驗(yàn)室濃縮而成，含生藥量為2.8 g/ml；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶為Gibco公司分裝，批號(hào)31800022；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品；MTT，上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide， DMSO），美國(guó)Fisher科學(xué)世界公司香港分公司產(chǎn)品；TE2000U多功能倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司產(chǎn)品；MK3酶標(biāo)儀，芬蘭雷勃公司產(chǎn)品。

　　1.2  益氣消積方含藥血清的制備

　　1.2.1  含藥血清的制備  選用正常SD大鼠36只，禁食12 h后，予益氣消積方煎液灌胃給藥。大鼠分為3個(gè)劑量組（每組12只）分別給藥，給藥劑量分別為，低劑量組1.17 g/kg，中劑量組5.85 g/kg，高劑量組11.7 g/kg，分別相當(dāng)于60 kg成日用量的同倍、5倍、10倍。給藥方式為每天分2次給藥，即采用一次及二次重復(fù)（2 h后相同劑量重復(fù)給藥一次）給藥方法。連續(xù)灌胃3 d，第3天第1次給藥2 h后再給藥1次，1 h后，乙醚麻醉，無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h以上，1 500 r/min，離心15 min，10 min后取血清，按灌胃濃度分別混合，56 ℃，30 min滅活，分裝，－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。

　　1.2.2  大鼠正常血清制備  對(duì)照組SD大鼠14只用生理鹽水灌胃，每只2 ml/次，2次/d，連續(xù)3 d.于第3天第1次灌胃2 h后再灌胃1次，1 h后，乙醚麻醉，無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h以上，1 500 r/min，離心15 min，10 min后取血清，56 ℃，30 min滅活，分裝，－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/P>

　　1.3  細(xì)胞培養(yǎng)  NKN28細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（含硫酸慶大霉素0.025 U/ml）中，于37 ℃、5％ CO2孵育箱中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)［2］。

　　1.4  倒置顯微鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察  上述培養(yǎng)細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，分別加入以上各組血清，在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，將培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下作生長(zhǎng)狀態(tài)觀察。

　　1.5  細(xì)胞抑制率的檢測(cè)  取濃度為1×105個(gè)/ml處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁生長(zhǎng)的人胃癌NKN28細(xì)胞，按1×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板（200 μl/孔），放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，吸棄培養(yǎng)板上清后加入高、中、低濃度含藥血清及空白血清，每種濃度設(shè)1/2、1/4、1/8、1/16四種不同比例，200 μl/孔，每種比例設(shè)6個(gè)復(fù)孔。放回培養(yǎng)箱中，使藥物與細(xì)胞共同孵育48 h和72 h.取出培養(yǎng)板，向每孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)上清，每孔加入DMSO 150 μl，再放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，使結(jié)晶物充分溶解之后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm處讀取各孔光密度值（即OD值）。抑瘤率（％）=（1－OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組）×100［3］。

　　1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。

　　2  結(jié)果

　　2.1  人胃癌NKN28細(xì)胞生長(zhǎng)狀況  倒置顯微鏡下，對(duì)照組的人胃癌NKN28細(xì)胞可見(jiàn)貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，胞漿均勻，細(xì)胞透明，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片；而經(jīng)含藥血清處理的各組細(xì)胞，24 h可見(jiàn)細(xì)胞由貼壁而脫落，至48 h脫落更明顯，脫落細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞形態(tài)變圓或不規(guī)則，細(xì)胞變暗。比較含藥血清各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，以高劑量組含藥血清組作用48 h脫落最明顯。說(shuō)明益氣消積方有抑制人胃癌NKN28細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，呈現(xiàn)一定的時(shí)間濃度依賴性。

　　2.2  MTT檢測(cè)結(jié)果

　　2.2.1  48 h不同濃度不同比例含藥血清的抑瘤作用  經(jīng)單因素方差分析，四組48 h不同濃度不同比例含藥血清對(duì)人胃癌NKN28細(xì)胞的抑瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)LSD組間檢驗(yàn)，在1/2、1/4血清比例時(shí)，高、中劑量組的抑瘤率均明顯高于空白血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組的抑瘤率略高于空白血清組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在1/8血清比例時(shí)，高劑量組的抑瘤率高于空白血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中、低劑量組的抑瘤率略高于空白血清組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在1/16血清比例時(shí)，高、中、低三個(gè)劑量組的抑瘤率略高于空白血清組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同時(shí)1/2、1/4、1/8血清比例時(shí)，高劑量的抑瘤率明顯高于各低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1/16血清比例時(shí)，高劑量的抑瘤率略高于各低劑量組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明益氣消積方有抑制人胃癌NKN28細(xì)胞增殖的作用，其抑制作用以高劑量組最佳。見(jiàn)表1.

　　2.2.2  72 h不同濃度不同比例含藥血清的抑瘤率  經(jīng)單因素方差分析，四組72 h不同濃度不同比例含藥血清對(duì)人胃癌NKN28細(xì)胞的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)LSD組間檢驗(yàn)，在各血清比例時(shí)，高劑量組的抑制率均高于空白血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在1/2、1/4血清比例時(shí)，中劑量組的抑制率高于空白血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在1/2血清比例時(shí)，低劑量組抑瘤率高于空白血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在各血清比例時(shí)，高劑量組的抑瘤率均高于各低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明益氣消積方有抑制人胃癌NKN28細(xì)胞增殖的作用，且這種抑制作用隨著中藥濃度及時(shí)間的增加而有所提高。見(jiàn)表2.

　　表1  48 h不同濃度不同比例含藥血清的抑瘤率（略）

　　Table 1  Inhibition rates of NKN28 cells after 48hour treatment of four groups of rat serum

　　*P＜0.05， vs normal control serum group； △P＜0.05， vs highdose group.

　　表2  72 h不同濃度不同比例含藥血清的抑瘤率（略）

　　Table 2  Inhibition rates of NKN28 cells after 72hour treatment of four groups of rat serum

　　*P＜0.05， vs normal control serum group； △P＜0.05， vs highdose group.

　　3  討論

　　本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法觀察了益氣消積方含藥血清抑制人胃癌NKN28細(xì)胞增殖的作用。益氣消積方以黃芪益氣扶正為君藥，白花蛇舌草和全蝎清熱、解毒、消積為臣藥。藥理研究證實(shí)白花蛇舌草提取物能激活T細(xì)胞，使其釋放干擾素γ，殺死腫瘤細(xì)胞，具有抗突變、抗煙焦油對(duì)淋巴細(xì)胞DNA的殺傷和增強(qiáng)人體非特異性免疫功能的作用；白花蛇舌草中含有微量元素如有機(jī)鍺，對(duì)氧自由基有較強(qiáng)的清除作用［4］。馬氏鉗蝎蝎毒可抑制和阻斷人食管癌細(xì)胞從G0/G1向S期增殖，從而抑制癌細(xì)胞增殖。其抗腫瘤作用，一是通過(guò)增強(qiáng)免疫功能取效，二是通過(guò)抑制癌細(xì)胞內(nèi)DNA合成，直接影響腫瘤的生存和增殖［5］。本實(shí)驗(yàn)表明，益氣消積方有較好的抑制人胃癌NKN28細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，且這種抑瘤作用呈現(xiàn)出時(shí)間、濃度依賴性。

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