【摘要】  觀察健脾活血方對(duì)酒精復(fù)合內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導(dǎo)的肝損傷大鼠庫(kù)普弗細(xì)胞活化信號(hào)通路的影響。方法：采用Lieber-Decarli酒精飲料飼養(yǎng)6周誘導(dǎo)的酒精性肝損傷模型，分設(shè)正常組，無(wú)酒精飲料組，酒精飲料組和酒精飲料加健脾活血方組，造模第3周起灌胃給藥或蒸餾水至第6周末，各組再以LPS 10 mg/kg 一次性灌胃，3.5 h后取材。檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase， ALT）活性和肝組織甘油三酯（triglyceride， TG）含量；HE染色觀察大鼠肝組織病理改變；CD68免疫組化觀察庫(kù)普弗細(xì)胞活化狀態(tài)；ELISA法檢測(cè)門脈血漿腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）含量；Western-blotting方法檢測(cè)肝組織TNF-α、磷酸化的IκB（phosphorylation-IκB， P-IκB）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）、CD68蛋白表達(dá)。結(jié)果：經(jīng)健脾活血方干預(yù)后，大鼠肝臟組織病理?yè)p傷減輕，肝組織TG含量以及血清ALT活性和門脈血漿TNF-α含量下降；同時(shí)，大鼠肝臟TNF-α、P-IκB、TLR4和CD68蛋白表達(dá)明顯減輕。結(jié)論：健脾活血方對(duì)酒精復(fù)合LPS誘導(dǎo)的肝損傷大鼠CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α具明顯抑制作用。

　　【關(guān)鍵詞】  肝疾病， 酒精性

　　酒精性肝病長(zhǎng)期以來(lái)是西方國(guó)家的主要肝臟疾病之一，而近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，其發(fā)病率在我國(guó)也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)［1］。目前，圍繞“二次攻擊”學(xué)說(shuō)， 內(nèi)毒素或脂多糖（lipopolysaccharides， LPS） 激活肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子是酒精性肝損傷研究的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)已知，LPS經(jīng)內(nèi)毒素受體如CD14、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）的作用激活肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞，活化核因子κB（nuclear factor κB， NF-κB）信號(hào)啟動(dòng)炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致肝損傷。我們前期的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，中藥復(fù)方健脾活血方具有抗Lieber-Decarli酒精飲料誘導(dǎo)的大鼠酒精性肝損傷的作用，并且進(jìn)一步證實(shí)該方能夠通過(guò)抑制酒精引起的腸滲漏［2］及脂質(zhì)過(guò)氧化［3］來(lái)達(dá)到上述的藥理作用。為了進(jìn)一步探討健脾活血方抗酒精性肝損傷的作用機(jī)制，本文觀察了該方對(duì)于Lieber-Decarli酒精飲料復(fù)合LPS灌胃二次攻擊誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型中LPS激活肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 動(dòng)物和藥物 SD雄性大鼠42只，體質(zhì)量150～160 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。健脾活血方由白術(shù)、白芍、丹參、澤瀉、五味子、姜黃、枳殼和葛根等組成。先提取藥物（白術(shù)和枳殼等）中的揮發(fā)性成分，然后再將藥物水提，最后將揮發(fā)油成分混合入水提物中。動(dòng)物用藥生藥含量為 0.9 g/ml .

　　1.1.2 主要試劑 Lieber-Decarli酒精飼料：無(wú)水乙醇，購(gòu)自上海振興化工一廠產(chǎn)品，分析純AR，批號(hào)200402359；干酪素，L-胱氨酸，DL-甲硫氨酸，玉米油，橄欖油，紅花油，麥芽糖糊精，纖維素，水溶性膳食纖維，酒石酸氫膽堿，黃原膠，磷酸氫鈣，氯化鈉，檸檬酸鉀，硫酸鉀，氧化鎂，硫酸錳，硫酸亞鐵，碳酸鋅，碳酸銅，碘酸鉀，亞硒酸鈉，硫酸鉻鉀，氟化鈉，蔗糖，鹽酸維生素B1，核黃素，鹽酸維生素B6，煙酸，泛酸鈣，葉酸，維生素H，維生素B12， 乙酸維生素A， 維生素D3，乙酸維生素E，甲基萘醌亞硫酸氫鈉，對(duì) 氨基苯甲酸，肌醇，右旋糖，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品。LPS（Escherichia coli 0111：B4），為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)時(shí)用滅菌注射用水溶解，工作終濃度1 mg/ml.檢測(cè)試劑：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine amin-otransferase， ALT）測(cè)定試劑盒，為衛(wèi)生部上海生物制品研究所產(chǎn)品；甘油三酯（triglyceride， TG）測(cè)定試劑盒，為浙江東甌生物工程有限公司產(chǎn)品。大鼠血漿TNF-α檢測(cè)試劑盒，為R&D公司產(chǎn)品；DAB濃縮顯色液和小牛血清白蛋白，均為上海華美生物工程公司產(chǎn)品；胃蛋白酶和多聚賴氨酸，均為北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司產(chǎn)品；二甲苯和蘇木素染料，均為上?；瘜W(xué)試劑廠產(chǎn)品；中性樹(shù)膠，為上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品；30%過(guò)氧化氫，為上海桃浦化工廠產(chǎn)品；苯甲基磺酰氟，為Serva公司產(chǎn)品；三氨基甲烷，為上海生物工程公司產(chǎn)品；β巰基乙醇、吐溫20、十二烷基硫酸鈉、N，N，N‘，N’-四甲基乙二胺、甘氨酸和40%Acr/Bis溶液，均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；甲醇，為Burdick & Jackson公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜和溴酚藍(lán)，均為Amersham公司產(chǎn)品。Nonidet P40和蛋白酶抑制劑，均為Roche公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光底物，為Pierce公司產(chǎn)品；脫脂奶粉，為Nestle公司產(chǎn)品；醫(yī)用X光膠片（12.7 cm×18.7 cm），為上海海鷗照相機(jī)有限公司感光材料廠產(chǎn)品；多克隆羊抗大鼠TNF-α抗體，為R&D公司產(chǎn)品。單克隆小鼠抗大鼠磷酸化IκB抗體（phosphorylation-IκB， P-IκB），為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；多克隆羊抗大鼠TLR4抗體，為Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品；單克隆小鼠抗大鼠CD68抗體，為Serotec公司產(chǎn)品；多克隆兔抗羊Ⅱ抗，為Jackson Immu-noresearch Laboratories Inc公司產(chǎn)品；單克隆兔抗小鼠Ⅱ抗，為Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 造模與分組 參照Lieber-DeCarli酒精飼料配方和美國(guó)杰弗遜大學(xué)醫(yī)學(xué)院酒精性肝病研究中心相關(guān)飼養(yǎng)方案，42只大鼠隨機(jī)分正常對(duì)照組（ 6只 ）；酒精液體飼料組（24只）和無(wú)酒精液體飼料組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組，12只），均單居。除正常組外，分別采用特制負(fù)壓式帶刻度玻璃容器，每日消毒后定量飼以酒精熱量占36%的Lieber-DeCarli酒精飼料和含相同熱量的無(wú)酒精對(duì)照飼料。第3周起，酒精液體飼料組再次隨機(jī)分為酒精液體飼料組（簡(jiǎn)稱模型組，12只）、酒精液體飼料加健脾活血方組（簡(jiǎn)稱中藥組，12只）。中藥組在給予酒精飼料的同時(shí)，灌胃給藥0.01 ml/g，1次/d，正常組、模型組和對(duì)照組按相同標(biāo)準(zhǔn)給予蒸餾水。

　　1.2.2 取材 造模6周后，大鼠禁食5 h，分別灌服LPS 10 mg/kg（間隔10 min灌1只），并在灌服LPS 3.5 h后，分別采取門靜脈血（無(wú)熱源肝素抗凝管收集制備血漿）、下腔靜脈血和肝組織。

　　1.2.3 觀察項(xiàng)目和方法 （1）大鼠一般狀態(tài)、進(jìn)食量及體質(zhì)量變化。（2）肝組織病理變化：HE染色，光鏡下觀察肝組織炎癥變化和脂肪變性程度。 （3）血 清ALT活性和肝組織TG含量：采用生化試劑盒檢測(cè)。（4）門脈血漿TNF-α含量測(cè)定：采用ELISA試劑盒測(cè)定。（5）肝組織CD68蛋白表達(dá)及分布：免疫組化染色法。Ⅰ抗，PBS稀釋，工作濃度1∶100；Ⅱ抗，PBS稀釋，工作濃度1∶250.（6）肝組織CD68、TLR4和TNF-α蛋白表達(dá)：Western-blotting法。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用 x ± s 表示，組間兩兩比較用 t 檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　2.1 一般狀態(tài)、進(jìn)食量及體質(zhì)量變化 對(duì)照組1只大鼠在灌飼LPS時(shí)意外死亡。各組大鼠進(jìn)食量和熱卡攝入無(wú)明顯差異，排除飲食及酒精量的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。造模前后同期各組大鼠體質(zhì)量無(wú) 明顯差異。

　　2.2 肝臟病理變化 模型組大鼠視野內(nèi)1/3以上的肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，以肝腺泡3帶為中心，其余的大部分肝細(xì)胞變性、腫脹，胞漿內(nèi)充滿小的空泡，即以酒精性脂肪肝病理表現(xiàn)為主。中藥組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度明顯減輕，脂滴數(shù)量減少。此外，對(duì)照組大鼠有3只也偶見(jiàn)有散在小泡狀脂肪滴。見(jiàn)圖1.

　　2.3 肝臟TG含量變化 模型組肝TG含量為正常組的9.4倍和對(duì)照組的4.9倍。健脾活血方可以明顯降低肝組織TG含量，中藥組TG含量均值為模型組的67%.見(jiàn)表1.

　　2.4 門靜脈血漿TNF-α含量和血清ALT活性的變化 模型組門靜脈血漿TNF-α含量和血清ALT活性明顯高于正常組和對(duì)照組。而中藥組的上述指標(biāo)均明顯低于模型組。見(jiàn)表1.

　　2.5 肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞活化狀態(tài) CD68免疫組化染色顯示，正常組和對(duì)照組大鼠肝臟肝小葉匯管區(qū)肝竇內(nèi)可見(jiàn)極少量CD68陽(yáng)性染色。模型組大鼠肝臟可見(jiàn)明顯的CD68陽(yáng)性染色區(qū)域，集中在肝細(xì)胞脂肪變性及炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯的匯管區(qū)肝竇內(nèi)。中藥組大鼠CD68陽(yáng)性染色較模型組明顯減少，但分布同模型組。見(jiàn)圖1.

　　2.6 肝組織CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白表達(dá)的變化 正常組大鼠肝組織CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白均有少量表達(dá)，對(duì)照組TNF-α蛋白表達(dá)也略有增加，模型組大鼠肝組織CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白表達(dá)則均明顯增加，而中藥組的上述蛋白表達(dá)均明顯低于酒精模型組。見(jiàn)圖2.

　　圖1 各組大鼠肝組織HE染色和CD68免疫組化染色（×200） （略）

　　Figure 1 HE staining for liver tissue and immunohistochemical staining for CD68 （×200）

　　A： HE staining for liver tissue； A1： Normal group； A2： Control liquid diet group； A3： Ethanol liquid diet group； A4： Jianpi Huoxue Decoction group. B： Immunohistochemical staining for CD68； B1： Normal group； B2： Control liquid diet group； B3： Ethanol liquid diet group； B4： Jianpi Huoxue Decoction group.

　　表1 大鼠肝組織TG含量、血漿TNF-α含量和血清ALT活性的變化（略）

　　Table 1 Contents of TG in liver， TNF-α in portal vein plasma and activity of ALT in serum

　　*P <0.05，*P <0.01， vs ethanol liquid diet group；△P <0.05，△△P <0.01， vs control liquid diet group.

　　圖2 健脾活血方對(duì)酒精性肝損傷復(fù)合LPS攻擊大鼠肝組織CD68、TLR4、P-IκB 、TNF-α蛋白表達(dá)的影響（Western-blotting）（略）

　　Figure 2 Effects of Jianpi Huoxue Decoction on protein expressions of CD68， TLR4， P-IκB and TNF-α in rats with liver injury induced by Lieber-Decarli diet and LPS （Western-blotting）

　　1： Normal group； 2： Control liquid diet group； 3： Ethanol liquid diet group； 4： Jianpi Huoxue Decoction group；

　　*P <0.05，*P <0.01， vs ethanol liquid diet group.

　　3 討論

　　近年來(lái)，由于“二次攻擊”學(xué)說(shuō)被不斷深入廣泛地研究，酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制研究取得了較大進(jìn)展。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞膜的主要脂質(zhì)成分，可以激動(dòng)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。大量研究表明，LPS通過(guò)活化庫(kù)普弗細(xì)胞（即肝巨噬細(xì)胞）產(chǎn)生炎癥因子參與了酒精性肝損傷的病理過(guò)程，庫(kù)普弗細(xì)胞源性的TNF-α在實(shí)驗(yàn)性酒精性肝病中發(fā)揮了重要的病理作用［4］。嗜酒者空腸微生物系中，革蘭陰性菌含量明顯增高［5］。長(zhǎng)期飼喂酒精的大鼠，用抗生素對(duì)其進(jìn)行腸內(nèi)滅菌或飼以乳酸菌，可降低酒精飼喂大鼠內(nèi)毒素水平和肝損傷的程度，防止轉(zhuǎn)氨酶的升高［6］。LPS體內(nèi)主要來(lái)源于腸道革蘭陰性桿菌。長(zhǎng)期的酒精作用可致使腸道通透性發(fā)生改變引起腸滲漏［7］，從而使腸道內(nèi)的內(nèi)毒素進(jìn)入血液。LPS信號(hào)的傳遞依賴于LPS受體的存在與活化。已經(jīng)證實(shí)TLR4是革蘭陰性菌LPS特異性受體［8］。TLR4基因突變的C3H/HeJ小鼠經(jīng)4周胃內(nèi)酒精灌注后，肝組織損 傷程度、轉(zhuǎn)氨酶水平、TNF-α mRNA表達(dá)水平均較野生型對(duì)照組明顯減輕［9］。LPS同血液中的LPS結(jié)合蛋白（LPS binding protein， LBP）形成復(fù)合物與效應(yīng)細(xì)胞膜上的膜型CD14相結(jié)合，在低濃度下激活效應(yīng)細(xì)胞（如單核/巨噬細(xì)胞，庫(kù)普弗細(xì)胞等）［8］。由于CD14缺乏跨膜功能區(qū)，LPS-LBP復(fù)合物與庫(kù)普弗細(xì)胞表面的CD14結(jié)合后，在模式識(shí)別受體TLR4的參與下完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TLR4下游信號(hào)通過(guò)胞內(nèi)一系列受體相關(guān)信號(hào)分子的參與最終誘導(dǎo)I-κB發(fā)生磷酸化降解，使NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)炎癥因子如TNF-α的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致肝損傷。中醫(yī)對(duì)于酒精性肝病有“傷酒”、“脅痛”、“酒癖”、“酒疸”和“酒臌‘等病名，認(rèn)為飲酒為外因，而素體稟賦不足、脾胃虛弱為內(nèi)因，健脾等調(diào)理脾胃運(yùn)化功能的治療方法是臨床治療酒精性肝病的基本治法治則。我們根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論及長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐總結(jié)了治療酒精性肝病的有效方劑健脾活血方，并經(jīng)前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)該方具有抗酒精性肝損傷的藥理作用。本研究重點(diǎn)觀察了健脾活血方對(duì)Lieber-Decar-li酒精飲料誘導(dǎo)的大鼠酒精性肝損傷復(fù)合LPS灌胃二次攻擊模型中LPS誘導(dǎo)庫(kù)普弗細(xì)胞活化信號(hào)通路的影響。大鼠肝臟組織病理學(xué)、血清ALT水平的觀察結(jié)果提示，該方能夠有效地抑制Lieber-Decarli酒精飲料復(fù)合LPS灌胃二次攻擊所致的肝損傷。同時(shí)，門脈血漿TNF-α含量、肝組織TNF-α蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果均提示該方能夠顯著降低造模后大鼠體內(nèi)TNF-α的表達(dá)，即健脾活血方能夠抑制該模型中炎癥因子TNF-α的釋放。進(jìn)一步觀察LPS活化庫(kù)普弗細(xì)胞信號(hào)通路的上游P-IκB及LPS受體表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，經(jīng)健脾活血方干預(yù)后，大鼠肝臟P-IκB和TLR4的蛋白表達(dá)明顯較模型組減輕。同時(shí)，免疫組化與Western-blotting檢測(cè)的結(jié)果也表明作為庫(kù)普弗細(xì)胞表面標(biāo)志分子的CD68蛋白表達(dá)在該方干預(yù)后明顯較模型組減輕，即健脾活血方能夠抑制該模型大鼠肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞的活化。本研究的結(jié)果提示，健脾活血方具有抑制Lieber-Decarli酒精飲料復(fù)合LPS灌胃二次攻擊所致的肝損傷及炎癥因子TNF-α釋放的藥理作用。同時(shí)，該方對(duì)肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞活化及LPS受體TLR4蛋白表達(dá)也具有明顯的抑制作用。

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