【關鍵詞】  胃腫瘤； 中藥； 增殖細胞核抗原； 表皮生長因子受體； 裸小鼠

　　中醫(yī)學認為惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移與痰邪為病有密切關系。魏品康教授根據多年臨床經驗研制出消痰散結復方治療胃癌，取得較好療效［1，2］。本研究建立裸鼠胃腺癌模型，觀察該藥對裸鼠胃腺癌體內生長的抑制作用及其對胃癌組織中增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）表達的影響，探討消痰散結復方抑制胃癌細胞增殖的作用機制，現報告如下。

　　1  材料與方法

　　1.1  實驗材料

　　1.1.1  實驗藥物及主要試劑  消痰散結方由半夏、天南星、茯苓、白芥子、陳皮、全蝎、雞內金、炙甘草等組成，均購自上海市藥材公司，產地明確，經第二軍醫(yī)大學藥學院生藥學教研室鑒定。常規(guī)方法煎煮，濃縮至含生藥0.46 kg/L備用。5氟尿嘧啶（fluorouracil， 5FU）10 ml，0.25 g，由上海旭東海普藥業(yè)有限公司出品（批號060404），購自長征醫(yī)院藥房。主要試劑鼠抗人PCNA單抗（稀釋度1∶100，代號M0879）和EGFR單抗（稀釋度1∶20，代號M0886）購自美國DAKO公司?？股锼氐鞍祖溇鬲策^氧化物酶（streptavidin peroxidase， SP）連接法試劑盒和顯色試劑盒，購自福建邁新公司。

　　1.1.2  實驗動物  BABL/c裸鼠，雄性，共45只，體質量（20～22）g，8～10周齡，由中國科學院腫瘤生物技術研究所提供。醫(yī)學實驗動物合格證書，編號0742；裸鼠動物合格證書，醫(yī)動字第02492號。

　　1.2  實驗方法

　　1.2.1  裸鼠MKN45胃腺癌模型建立  裸鼠MKN45人胃腺癌細胞株由中國科學院腫瘤生物技術研究所提供。制備接種細胞懸液，無菌操作。體外培養(yǎng)MKN45細胞生長密集時，用0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）消化1～2 min，傾出消化液，加入無血清1640液洗滌，離心，用無血清1640液配成接種細胞，濃度為2×106/ L.用相差顯微鏡觀察呈均勻的單細胞懸液。皮下接種：無菌操作，消毒皮膚，取l ml注射器，抽吸出0.4 ml細胞懸液，接種在裸鼠右前肢根部皮下。裸小鼠皮下移植傳代，取傳代后14 d左右的裸小鼠，無菌操作，從腋部皮下剝取腫瘤組織，剔除纖維包膜，切開，選取生長良好、呈淡紅色、魚肉狀瘤組織，切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，置于生理鹽水中備用。裸鼠稱質量后以75 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，沿上腹正中線切開約1 cm，將備好的腫瘤組織塊植入。術后逐日觀察腫瘤生長情況，以小鼠腹部出現可觸及的包塊作為成瘤標志，觀察小鼠一般活動及營養(yǎng)狀態(tài)等變化。

　　1.2.2  實驗動物分組及用藥  將接種后的BABL/c裸鼠隨機分為3組，消痰散結方組、化療組及荷瘤對照組，每組各15只，無特定病原菌（specific pathogen free， SPF）條件下分籠飼養(yǎng)于層流架內。消痰散結方組，于接種后次日開始每只裸鼠灌服消痰散結方濃縮煎劑0.4 ml/次（相當于生藥9.2 g/kg體質量）1次/d，連續(xù)灌胃6周?？瞻缀闪鰧φ战M，亦于接種后次日開始每只裸鼠灌服生理鹽水0.4 ml/次，1次/d，連續(xù)灌胃6周?；熃M，5FU以生理鹽水稀釋成7.5 mg/ml，參照文獻及本組以往研究經驗按60 mg/kg腹腔注射，1次/周，連續(xù)用藥3周。

　　1.2.3  移植瘤生長、小鼠活動及營養(yǎng)狀況觀察  接種后觀察小鼠活動、進食及營養(yǎng)情況。6周后拉頸處死裸鼠，從腋部皮下完整剝取腫瘤組織，剔除纖維包膜，于電子天平上稱取瘤質量。運用公式抑瘤率（%）＝（對照組治療后平均瘤質量－用藥組治療后平均瘤質量）/對照組治療后平均瘤質量×100計算抑瘤率。完成觀察及稱取質量的瘤組織用中性福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。

　　1.2.4  移植瘤組織PCNA、EGFR的測定  SP法，蘇木素伊紅染色，石蠟切片脫蠟至水，微波修復抗原。每張切片滴加一抗（鼠抗人PCNA、EGFR）1滴，4℃冰箱過夜，PBS沖洗3次后滴加生物素化二抗，每張切片上加1滴抗生物素蛋白鏈菌素過氧化物酶溶液，3，3‘二氨基及聯苯胺底物顯色10 min，二甲苯透明，中性樹膠封閉。PCNA染色陽性物質呈棕黃色，顆粒狀，位于胃癌細胞核內，在×200油鏡下，隨機計數200個以上的細胞作為分析基數，計數標記PCNA指數，即被標記細胞在一細胞群中所占的百分率。EGFR陽性染色大多位于胞漿及胞膜上，個別位于胞核上，為棕黃色顆粒，按染色深度和陽性細胞所占比例分別計分。（1）染色深度：0分，無著色；1分，淺著色；2分，深著色。（2）陽性細胞比例：0分，無著色；1分，著色≤1/3；2分，1/3＜著色≤2/3；3分，著色＞2/3.兩項結果相加＞3分為陽性。

　　1.3  統(tǒng)計學處理  采用多個樣本均數間兩兩比較F檢驗與不配對資料t檢驗，不同組間表達比率采用四格表資料的χ2檢驗，運用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理。

　　2  結果

　　2.1  消痰散結方對裸鼠MKN45胃腺癌生長的影響  荷瘤對照組在MKN45人胃腺癌接種于裸鼠皮下后14 d左右，腹部開始觸及結節(jié)型腫塊，以后逐漸增大。中藥組晚于對照組觸及腫塊，化療組又稍晚于中藥組觸及腫塊?；熃M第23天死亡1只，且化療后期裸鼠消瘦明顯，懶動，飲水、進食狀況均較差。對照組4周后也逐漸有類似情況，但較化療組為輕。中藥組裸鼠整個治療周期活動、飲食生長狀況均較穩(wěn)定，優(yōu)于前二者。6周后處死裸鼠，稱取瘤質量，計算抑瘤率，化療組和消痰散結方組抑瘤率分別為65.71%和52.72%，其瘤質量與荷瘤對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），化療組較空白對照組差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1.

　　表1  各組移植瘤瘤質量及抑瘤率（略）

　　Table 1  Tumor weight and inhibition rate in different groups

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs control group.

　　2.2  瘤組織病理學觀察  瘤體組織切片在光鏡下呈現低分化腺癌特征。對照組瘤細胞體積較大，呈橢圓形，胞漿紅染，細胞核大而色深，核漿比例明顯失調，化療組與消痰散結方組的瘤細胞相對較小，核漿比例也相對接近正常，胞漿有空泡，核結構模糊。見圖1.

　　圖1  各組瘤組織病理學觀察（HE染色， ×200）（略）

　　Figure 1  Pathological observation of tumor tissue （HE， ×200）

　　A： Control group； B： Xiaotan Sanjie Recipe group； C： 5FU group.

　　2.3  瘤組織中PCNA、EGFR表達  消痰散結方組PCNA陽性表達率低于空白對照組（P<0.05），化療組PCNA陽性表達率與空白對照組比較，差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示中藥組及化療組細胞增殖程度均不如空白對照組活躍，見表2和圖2.EGFR陽性表達情況如圖3及表3所示，消痰散結方可明顯下調胃癌細胞膜EGFR表達。

　　表2  各組瘤組織中PCNA陽性表達（略）

　　Table 2  Positive expression of PCNA in different groups

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs control group.

　　圖2  各組瘤組織中PCNA陽性表達（SP，×200）（略）

　　Figure 2  Positive expression of PCNA in different groups （SP， ×200）

　　A： Control group； B： Xiaotan Sanjie Recipe group； C： 5FU group.

　　圖3  各組瘤組織中EGFR陽性表達（SP，×200）（略）

　　Figure 3  Positive expression of EGFR in different groups （SP， ×200）

　　A： Control group； B： Xiaotan Sanjie Recipe group； C： 5FU group.

　　表3  各組瘤組織中EGFR陽性表達（略）

　　Table 3  Positive expression of EGFR in different groups

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs control group.

　　3  討論

　　腫瘤細胞無限增殖在一定程度上反映腫瘤細胞代謝和DNA合成狀態(tài)。PCNA相對分子量為36 000，既是控制細胞DNA合成的必需非組蛋白核內多肽，也是細胞DNA合成期DNA多聚酶δ輔助蛋白。靜止細胞中PCNA含量很少，細胞進入增生周期開始逐漸增加，S期達到高峰，G2期和Ml期明顯下降，對DNA合成的調節(jié)和復制起重要作用。Tao 等［3］發(fā)現PCNA標記指數與胃癌的浸潤、分期密切相關，國內文獻研究也證實PCNA的表達與腫瘤細胞增殖活性密切相關［4～6］，故PCNA被認為是能較好判斷細胞增殖活性的內源性標記物，細胞增殖活性又反映腫瘤的惡性傾向。腫瘤自分泌假說認為，生長因子受體質或量的異常，生長因子類物質產生的異常，受體后信號傳導系統(tǒng)紊亂，生長因子或抑制因子減少等等，均可導致細胞生長調節(jié)機制失控，細胞惡性增殖可引起腫瘤發(fā)生。EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性，當與表皮生長因子結合形成復合體后，其自身酪氨酸殘基被磷酸化，幾乎所有信號傳導通路均以蛋白激酶或磷酸酶的激活作為調節(jié)細胞生物效應的手段，或作為與其他信號系統(tǒng)相互溝通聯系的交匯點［7］。研究表明EGFR在生理狀態(tài)下對細胞生長和分化具有調節(jié)作用，當EGFR過度表達時，可引起細胞生長增殖調節(jié)機制的失控，導致細胞惡性增殖［8，9］。胃癌屬于中醫(yī)學“伏梁”、“積聚”、“胃脘痛”、“胃反”、“噎膈”等病證范疇，文獻對其形成的病因病機有諸多描述，其中“痰凝”為重要病理因素之一。魏品康教授30余年來一直從事消化系統(tǒng)惡性腫瘤防治工作，認為胃癌多因長期飲食不慎，勞倦所傷，影響脾胃運化功能，導致水濕不化，日久凝聚為痰，進一步影響氣血運行，導致痰凝血壅，結而成塊，故而主張消痰散結論治，驅邪為主，邪去則正安，遂擬定消痰散結方。方中以南星、半夏、陳皮、白芥子等消痰散結，再以全蝎破瘀散結，甘草調和諸藥，并與雞內金等協(xié)助減輕南星、半夏、全蝎毒副作用，攻補兼施，但偏重于攻。在臨床應用多年，證實可明顯改善患者生活質量，提高中位生存期［1］。本實驗即在臨床研究基礎上，建立裸鼠胃癌模型，從實驗研究角度對其作用機制進行探討，結果提示消痰散結方對裸鼠移植瘤生長有一定抑制作用，并進一步檢測了不同分組胃癌組織中反應細胞增殖活性的PCNA表達，以及對細胞生長增殖有調節(jié)作用的EGFR表達，結果提示消痰散結方能下調細胞PCNA標記指數以及細胞膜EGFR表達，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明消痰散結方可通過抑制PCNA蛋白和細胞膜EGFR表達，干擾腫瘤細胞DNA合成，對細胞增殖相關信號通路產生影響，進而抑制胃癌細胞增殖。本文從實驗研究角度證實了消痰散結方的抗腫瘤功效，有關此方藥的作用機制值得進一步深入探討。

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