【關鍵詞】  糖尿病； 皮膚潰瘍； 轉化生長因子β1； 大鼠

　　糖尿病潰瘍是糖尿病的常見并發(fā)癥之一。益氣化瘀中藥治療糖尿病潰瘍取得了良好療效［1］，為進一步探討其促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的機制，開展了本研究。

　　1  材料與方法

　　1.1  實驗動物  清潔級2月齡SD大鼠60只，雄性，體質量200～250 g，平均（223.05±14.91）g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。動物合格證號：醫(yī)動字第02222號。

　　1.2  藥物  益氣化瘀方由生黃芪、太子參、桃仁和地龍組成，劑量比例為2.5∶2.5∶1∶1，大鼠的劑量為11.61 g/（kg.d），減壓濃縮至濃度為含生藥2.5 g/ml.拆方益氣方由生黃芪和太子參組成，大鼠的劑量為6.75 g/（kg.d），減壓濃縮至濃度為含生藥1.5 g/ml.拆方化瘀方由桃仁和地龍組成，大鼠的劑量為4.86 g/（kg.d），減壓濃縮至濃度為含生藥1 g/ml［2］。均由上海中醫(yī)藥大學龍華醫(yī)院制劑室按水煎醇沉工藝制備成煎劑濃縮，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）貝復濟，珠海東大生物制藥有限公司產品（批準號：國藥準字S10980077）。

　　1.3  主要實驗試劑  轉化生長因子β1（transforming growth factorβ1， TGFβ1）一抗，Santa Cruz公司產品（Sc146），工作濃度1∶80；HRP標記山羊抗兔二抗，北京中山生物工程公司產品（ZB2301）；化學發(fā)光底物，Pierce公司產品；NC膜（0.45 μm），Millipore公司產品。

　　1.4  主要實驗儀器  RM2145切片機，Leica公司產品；IMS細胞圖像分析儀，上海申騰信息技術有限公司產品；MVCP410攝像機，Panasonic公司產品；BH2顯微鏡，Olympus公司產品；DYY8C電泳儀、DYCZ24D電泳槽和DYCZ40D轉印槽，均為北京六一儀器廠產品；721分光光度計，上海分析儀器總廠產品。

　　1.5  糖尿病潰瘍大鼠模型建立  實驗前12 h禁食，定量飲水。將1％鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）溶液，以60 mg/kg劑量腹腔內注射2 d.3 d后動物血糖濃度大于16.7 mmol/L及尿糖為（++++）時，即成糖尿病鼠模型。參照付小兵等［3］全層皮膚缺損法制成動物體表潰瘍模型，將糖尿病大鼠用鹽酸氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉后背部備皮，在脊椎兩側分別作直徑15 mm的圓形標記，在無菌條件下，用外科方法切除標記處全層皮膚，止血后用無菌紗布覆蓋，即成糖尿病潰瘍模型。造模后每只大鼠每日予青霉素40萬U肌肉注射，連續(xù)4 d.

　　1.6  實驗動物分組及給藥方法  60只大鼠先隨機抽取10只為正常對照組；其余50只大鼠建立糖尿病潰瘍模型，成模后再隨機分為益氣化瘀組、益氣組、化瘀組、貝復濟組和模型組。各組于造模后次日開始給藥，換藥前均以1/5 000呋喃西林溶液清潔創(chuàng)面。正常對照組及模型組外敷單層生理鹽水紗布，生理鹽水灌胃，1次/d；益氣化瘀組、益氣組和化瘀組外敷單層生理鹽水紗布，中藥灌胃，1次/d；貝復濟組灌服等量生理鹽水，外敷以貝復濟浸透紗布（60 U/cm2），按創(chuàng)面大小剪成小塊貼于創(chuàng)面上，然后均在創(chuàng)面上加蓋兩層消毒干紗布，用膠布“豐”字形固定。連續(xù)用藥7 d，用藥后第8天，分別將動物麻醉（鹽酸氯胺酮），取局部創(chuàng)面新生肉芽組織為所需實驗樣品。

　　1.7  實驗方法

　　1.7.1  免疫組織化學SP法及圖像分析  每組隨機抽取8個標本作為實驗樣本，取4 μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟，PBS沖洗3次，3 min/次；3％ H2O2室溫20 min，PBS沖洗3次，3 min/次；檸檬酸鹽緩沖液中微波處理（98 ℃）2次，10 min/次；10%正常血清封閉內源性非特異性抗原，室溫30 min，一抗4 ℃過夜，PBS沖洗3次，3 min/次；生物素化羊抗兔IgG 1∶200，37 ℃ 30 min，PBS沖洗3次，3 min/次；StreptavidinHRP 1∶200，37 ℃ 30 min，PBS沖洗3次，3 min/次；DAB顯色8～12 min，水洗；蘇木素襯染，水洗，吹干，樹脂封片。顯微鏡下觀察，有棕黃染色者為陽性。采用IMS細胞圖像分析系統(tǒng)，對各組免疫組化切片進行圖像分析。根據(jù)各組切片中的染色條件，在統(tǒng)一閾值下進行。在10倍物鏡下，每張切片隨機選取3個視野，輸入圖像，測定各組在統(tǒng)一光度下陽性細胞的總面積。

　　1.7.2  Western blotting法  每組隨機抽取6個標本作為實驗樣本，分別取大約200 mg組織制備樣品，提取創(chuàng)面肉芽組織總蛋白，各樣品取30 μg上樣，Marker取10 μl上樣（上樣前按說明書進行預處理），進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電轉移至硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉封閉，分別與特異性的TGFβ1抗體進行孵育，充分洗滌后孵育HRP標記山羊抗小鼠抗體，電化學發(fā)光，X線攝片。用Quantity One 4.3.1（Biorad）軟件對照片進行掃描分析，測定蛋白表達量。

　　1.8  統(tǒng)計學方法  采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，以方差分析比較各組間TGFβ1表達水平的差異。

　　2  結果

　　2.1  免疫組織化學法檢測各組創(chuàng)面肉芽組織中TGFβ1的表達水平  模型組TGFβ1表達明顯低于正常對照組（P＜0.01）；益氣化瘀組TGFβ1表達量高于益氣組、化瘀組、貝復濟組和模型組（P＜0.05或P＜0.01），與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；益氣組和化瘀組的TGFβ1表達量也明顯高于模型組（P＜0.01），與貝復濟組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；益氣組和化瘀組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1、圖1.

　　2.2  Western blotting法檢測各組創(chuàng)面肉芽組織中TGFβ1的表達水平  模型組TGFβ1表達明顯低于正常對照組（P＜0.01）；益氣化瘀組TGFβ1表達量明顯高于益氣組、化瘀組、貝復濟組和模型組（P＜0.01），與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；益氣組和化瘀組明顯高于模型組（P＜0.01），益氣組和化瘀組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1、圖2.

　　表1  各組創(chuàng)面TGFβ1的表達（略）

　　Table 1  TGFβ1 expression of skin ulcers in rats with diabetes

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs untreated group； △P＜0.05， △△P＜0.01， vs normal control group； ▲P＜0.05， ▲▲P＜0.01， vs Yiqi Recipetreated group； □P＜0.05， □□P＜0.01， vs Huayu Recipetreated group； ■P＜0.05， ■■P＜0.01， vs bFGFtreated group.

　　圖1  術后第7天各組大鼠肉芽組織中TGFβ1的表達水平（SP， ×100）（略）

　　Figure 1  Expression of TGFβ1 in granulation tissue of the rats in six groups seven days after skin lesion （SP， ×100）

　　A： Yiqi Huayu Recipetreated； B： Yiqi Recipetreated； C： Huayu Recipetreated； D： Untreated； E： bFGFtreated； F： Normal control.

　　Yiqi Huayu Recipetreated； B： Yiqi Recipetreated； C： Huayu Recipetreated； D： Untreated； E： bFGFtreated； F： Normal control.

　　圖2  術后第7天各組6個大鼠肉芽組織樣本中TGFβ1的表達水平（Western blotting）（略）

　　Figure 2  Expression of TGFβ1 in granulation tissue of the rats in six samples seven days after skin lesion （Western blotting）

　　3  討論

　　糖尿病潰瘍的發(fā)生、發(fā)展和變化是“因虛感邪，邪氣致瘀，瘀阻傷正”的過程，其病本虛標實，正氣不足，氣陰兩虛為其本，濕熱互結，氣血瘀滯為其標。“虛”、“瘀”是糖尿病患者創(chuàng)面難以愈合的關鍵。唐漢鈞教授在長期臨床和實驗研究的基礎上，認為只有氣血足、瘀滯祛除，才能斷生腐之源，生肌長皮，故以“祛瘀生新”為指導，提出“祛瘀生肌”、“補虛生肌”理論，臨床以益氣化瘀法為主治療糖尿病取得良好的臨床療效［4］。隨著近年來分子生物學等學科的發(fā)展，對糖尿病創(chuàng)面愈合機制的研究日趨深入。多種細胞、細胞因子和細胞外基質之間錯綜復雜的網(wǎng)絡作用是該過程中的關鍵因素之一［5］。各種生長因子參與了傷口愈合的調控，在組織修復中有決定意義。其中TGFβ的主要作用是調節(jié)細胞的生長和分化，誘導細胞外基質的合成及細胞凋亡，是一類對創(chuàng)面修復有重要調控作用的多功能的生長因子［6］。TGFβ主要分為三個亞型。遭受創(chuàng)傷后，TGFβ1、2、3的表達開始增加，其中TGFβ1的表達時程變化與微小血管形成有一致性，說明TGFβ1對血管形成有影響作用。TGFβ2、3的表達持續(xù)時間較長，可能參加愈合后期的組織塑性。而主要發(fā)揮增加膠原沉積，加速創(chuàng)傷愈合，同時促進瘢痕形成作用的為TGFβ1.因此，TGFβ1在潰瘍創(chuàng)面組織中含量的變化對潰瘍發(fā)生和修復愈合發(fā)揮核心作用，其表達水平的高低直接關系到創(chuàng)面愈合的速度和質量。國內外研究發(fā)現(xiàn)，皮膚傷口愈合包括連續(xù)而又相互重迭的3個階段，即炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期［7］。傷后第7天，即創(chuàng)傷愈合的中期，是成纖維細胞增生和膠原合成的高峰期，TGFβ1的含量在此時也達到最高值［8， 9］。TGFβ1在早中期表達的升高，對促進成纖維細胞合成膠原蛋白、蛋白聚糖、纖維聯(lián)接蛋白和整合蛋白，增強上皮細胞遷移與成纖維細胞合成細胞外基質有關鍵性作用，是其促進創(chuàng)面愈合的一個重要方面［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組創(chuàng)面愈合率較低，愈合時間較長，并且TGFβ1表達水平也較低（P＜0.01），提示糖尿病創(chuàng)面難以愈合可能與TGFβ1表達水平下降有密切關系。益氣化瘀組、益氣組及化瘀組的創(chuàng)面愈合率較高，愈合時間短，與模型組相比，創(chuàng)面TGFβ1的表達明顯增高（P＜0.01），且益氣化瘀組TGFβ1的表達高于益氣組及化瘀組。因此可以初步證明，在創(chuàng)傷愈合的早中期運用益氣化瘀中藥，可能通過上調TGFβ1的表達水平而促進創(chuàng)面愈合，且益氣及化瘀中藥也分別有一定程度的作用。結合TGFβ1促進成纖維細胞增生和膠原合成的主要生物學作用，也初步印證了“化瘀生肌”和“補虛生肌”的學術理論。益氣化瘀組的治療效果要優(yōu)于益氣組和化瘀組。《醫(yī)林改錯》有云：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無力，必停留而瘀?！睔鉃檠獛洠j脈空虛，則無力推動血行，使氣血運行稽遲，瘀血內生，或停留于局部而為瘀；瘀血不去，新血不生，正氣無由恢復，則正氣耗損益劇，兩者互為因果。而益氣法和化瘀法中藥配伍使用，正氣足則瘀滯除，瘀祛則新生，兩者相互為用，其作用更為顯著，體現(xiàn)了中醫(yī)相須配伍的科學性，是臨床取得療效的關鍵所在，也體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的精華。

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