瘧疾核酸免疫的研究進展

2004-10-06 10:47 醫(yī)學教育網(wǎng)

　　聯(lián)合國開發(fā)計劃署/世界銀行/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合倡建的熱帶病特別規(guī)劃防治的6種主要熱帶病中，除麻風病外，其余5種都是寄生蟲病，而瘧疾則是危害性最大的一類寄生蟲病。盡管全國世界以蚊媒控制和藥物治療為中心的大規(guī)模防治計劃開展了近40年，但目前仍有100個國家和地區(qū)不同程度地受到疾疾的威脅。由于環(huán)境改變和流動人口的增加，受威脅人口很大的可變性。據(jù)估計，1994年有23億人口（占世界人口的41%）居住在受瘧疾威脅的地區(qū)。估計全世界瘧疾發(fā)病每年3－年億例，死亡人數(shù)為150－270萬人。大約100萬例5歲以下兒童死亡是由瘧疾或同時伴有其它疾病所致[1]，因而瘧疾疫苗的研制勢在必行，并已成為瘧疾防治中的重要內容。

　　瘧原蟲生活史有多個時期，每個生活史期有多種抗原，而且每種抗原具有多個表位，有些抗原還有多個等位基因，相同抗原又有多種結構形式，免疫系統(tǒng)有多種作用因子，而不同宿主的免疫反應也不相同，所有的這些因素給瘧疾疫苗的研制帶來了許多困難[2].從現(xiàn)有的瘧疾疫苗看，瘧疾的第一代疫苗——全蟲減毒疫苗激發(fā)的免疫反應低下，臨床試驗效果不佳。即使是寄予厚望的第二代疫苗——基因工程亞單位疫苗和化學合成多肽疫苗，也由于表達產物翻譯后的修飾功能較差難以確保抗原的天然構型及免疫原性，特別是對保護性抗原多為糖蛋白的蟲體生活史時期來說更是難以達到免疫保護效果，同時表達產物的純化過程也極為復雜，給實際應用帶來了困難。因此，近年興起的核酸免疫為瘧疾疫苗的研制帶來了希望。核酸疫苗被看作是極具發(fā)展?jié)摿Φ牡谌呙鏪3].核酸免疫已成為預防和治療傳染病的一種有希望的基因治療方法，帶有病原體抗原基因的質粒DNA直接導入宿主細胞，可激發(fā)出針對編碼抗原的特異性細胞免疫應答和/或體液免疫應答[4].在短短的幾年中核酸免疫已取得了長足的進展，本文就核酸免疫在瘧疾疫苗研制中的應用作一綜述。

　　1鼠約氏瘧原蟲的DNA疫苗

　　1.1環(huán)子孢子DNA疫苗

　　約氏瘧原蟲（P，yoelii）環(huán)子孢子蛋白（CSP，391aa）（簡稱為PyCSP）是子孢子表面表達最多的一種抗原，它也可表達于紅外期寄生蟲的質膜和納蟲泡膜上。PyCSP是保護性免疫應答的靶抗原，過繼轉移PyCSP特異的CD8+和CD4+T細胞可保護小鼠的子孢子攻擊感染。而在體外，PyCSP特異的CD8+細胞毒T淋巴細胞（CTL）可以MHC-限制方式消滅培養(yǎng)感染肝細胞，而且針對PyCSP高度顯位重復區(qū)的抗體可在體外抑制子孢子的侵入，并可被動傳遞免疫保護作用給未受感染的小鼠[5].

　　Sedegah等[6]將重新構建的含有PyCSP基因的質粒DNA直接肌肉注射免疫小鼠，并與輻射減毒子孢子的免疫效果相比較。結果發(fā)現(xiàn)，核酸免疫小鼠可發(fā)產生抗CSP的特異性抗體和CTL反應，它們的反應水平均高于減毒子孢子免疫的小鼠。核酸免疫小鼠用5×105子孢子進行攻擊感染，結果肝期寄生蟲的負荷可減少86%；而以102子孢子攻擊感染經(jīng)過2－3次核酸免疫的動物，發(fā)現(xiàn)核酸疫苗對68%（18/28）的小鼠具有保護作用，并且這種保護作用依賴D8+T細胞。盡管PyCSP質粒DNA免疫BALB/c小鼠可以劑量依賴形式誘導出高水平的CSP特異性抗體，且比減毒子孢子免疫鼠抗體水平高10－15倍，然而通過體外檢測抗體對子孢子侵入肝期的寄生蟲生長發(fā)育的抑制作用，發(fā)現(xiàn)該DNA疫苗誘導的抗體應答只有中等水平的生物學活性。提示，上述DNAU疫苗的保護作用主要依賴于CTL介導的免疫應答。說明核酸免疫可用于抗瘧原蟲感染。PyCSP質粒DNA免疫可誘導針對PyCSP的一種已被鑒定但尚未命名的CTL抗原特異性表位、MHC限制的CD8+CTL，且CTL應答與抗體應答呈相關關系。PyCSPdNA免疫誘導的CTL的水平（70%－80%特異性溶解靶細胞）明顯高于射線減毒子孢子（20%－30%特異性溶解靶細胞）免疫誘導的保護性免疫水平。Hoffman等[7]同樣構建了可編碼PyCSP基因的重組質粒進行動物免疫試驗，獲得了與Sedegah等[8]報道相似的免疫效果。同時他們還發(fā)現(xiàn)，免疫注射3次（20-40μg/次）質粒DNA可達到與每次注射200μg相同的保護性免疫效應，而且延長免疫間隔期似處可增強免疫效應。

　　許多研究表明，MHC和非MHC基因可調控小鼠對約氏瘧原蟲感染的保護作用，而且針對惡性瘧原蟲（P.falciparum）、間日瘧原蟲（P.vivax）、約氏瘧原蟲及伯氏瘧原蟲（P.berghei）的CD8+和CD4+T細胞表位和B細胞表位的免疫應答均受遺傳基因的限制。因此，為考察DNA疫苗在P.yoelii鼠模型中的保護效果，Doolan等[8]利用能編碼PyCSP的質粒DNA免疫5株近交系小鼠，它們的遺傳背景和H-2單倍型分別為BALB/c（H-2d）、A/J（H-2a）、B10.BR（H-2k）、B10.Q（H-2q）及C57BL/c（H-2b）。同時還免疫了另一株遠交系小鼠CD-1.結果只有BALB/c（H-2d）小鼠獲得高效免疫，其抵抗攻擊感染的保護率為75%.

　　1.2肝細胞紅細胞蛋白DNA疫苗

　　用單克降抗體NYLS3（NYLS3-McAb）在約氏瘧原蟲感染的肝細胞和紅細胞的納蟲泡膜上可鑒定出一種17kDa的蛋白抗原，這種抗原被命名為肝細胞紅細胞蛋白（PyHEP17），它也是保護性免疫應答的靶抗原[9].NYLS3-McAb可以特異地消滅培養(yǎng)的肝期寄生蟲。在體內，被動轉移NYLS3-McAb給未感染動物，可以降低原蟲血癥的蟲體數(shù)量。Doolan等[8]用肝內及無性血液期均表達PyHEP17的cDNA構建的質粒DNA作為疫免疫小鼠，結果可保護5株近交系中的3株，其單倍型及保護率分別為H-2a，71%；H-2k，54%；H-2d，26%，而且B10.BR小鼠（H-2a）則僅有17%的保護率，C57BL/c（H-2b）則不能保護攻擊感染。遠交系小鼠CD-1則表現(xiàn)出40%－50%的保護率。但PyHEP17質粒DNA免疫并不能保護小鼠對血液期瘧原蟲的攻擊感染。核酸免疫可在BALB/c小鼠中誘導出抗原特異、MHC限制的CD8+CTL，而A/J或B10.BR則檢測不到CTL.與PyCSP質粒DNA免疫不同的是，PyHEP17質粒DNA免疫鼠誘導的CTL與抗體產量并不呈相關關系，因為在所有的5株小鼠中幾乎檢測不到抗體的產生。

　　1.3核酸疫苗的基因調控

　　上述研究結果表明，PyCSP或PyHEP17質粒DNA免疫誘導的保護性免疫作用受基因調控，且早期的研究證明免疫應答也受基因調控。提示，針對瘧疾的單一效價疫苗無法保護遺傳背景復雜的遠交系動物和人類；即使在近交系小鼠中，PyCSP和PyHEP17質粒DNA的免疫效果也表現(xiàn)出遺傳限制的不同保護模式。Doolan等[8]試用上述兩種質粒DNA（PyCSP和PyHEP17）的混合物免疫接種，以確定這種遺傳限制的免疫保護模式是否可被二價DNA疫苗所阻斷。結果發(fā)現(xiàn)，在B10.BR小鼠中，單價PyCSP或PyHEP17質粒DNA免疫后的保護分別為8%和54%，而兩者的混合物同時免疫則可誘導85%的保護率，在BALB/c和A/J兩株小鼠中，經(jīng)二價疫苗免疫后也表現(xiàn)出明顯升高的保護率（80%－90%），則另外兩株小鼠則未能完全保護，從而導致了瘧原蟲血癥的發(fā)生，但其出現(xiàn)時間與對照組相比推遲了4天，與其90%的感染肝細胞被消滅相一致。因此，二價DNA疫苗可保護不同遺傳背景和H-2單倍型的小鼠，并在B10.BR小鼠中，這種保護作用呈現(xiàn)疊加效應。這些結果提示，小鼠對核酸疫苗誘發(fā)的免疫應答受基因調控，單一效價的疫苗似乎很難對不同遺傳背景的個體提供完全的保護作用，而二價的DNA疫苗則可以保護不同遺傳背景及H-2單倍型的小鼠，同樣也只有二價或多價的核酸疫苗方可保護遺傳背景更復雜的人類。同時本試驗結果還表明，可用與PyHEP17同源的惡性瘧原蟲基因構建質粒DNA以進行人體惡性瘧原蟲的免疫研究。

　　1.4裂殖子表面蛋白DNA疫苗

　　約氏瘧原蟲裂殖子表面蛋白1抗原（PyMSP-1）首先被合成為一種大分子量的前體（190-230kDa，分子量大小與寄生蟲種株不同有關），隨后被分解成4個片段[10].大量的證據(jù)表明，在鼠類和靈長類瘧疾模型中，PyMSP-1也是一種保護性應答（主要為抗體介導的）靶抗原。Kang等[11]將編碼PyMSP-1c端片段（PyC2）與GST融合蛋白（GST-PyC2）的基因構建成一種質粒DNA疫苗（V3），將V3免疫BLAB/c小鼠，可成功地誘導產生抗PyC2抗體。這些抗體可免疫沉淀天然的pyMSP-1蛋白并可與McAb302（針對PyC2的McAb）競爭結合PyMSP-1的表位，這種競爭作用與GST-PyC2蛋白免疫誘發(fā)的抗體相似。但是，與GST-PyC2蛋白免疫產生的抗體相比，這些抗體的滴度及親和力較低，而抗體的同種型構成和抵抗紅內期寄生蟲的致死性攻擊的保護能力也不相同。與蛋白免疫相比，在DNA免疫過程中，GST或PyC2特異的IgG抗體的親和力也未見明顯的增強。這些結果提示，在本試驗系統(tǒng)中，DNA免疫期間可能幾乎不存在成熟的特異性抗體親和力。

　　2伯氏瘧原蟲的DNA疫苗

　　Leitner等[12]用兩個表達伯氏瘧原蟲CSP（PbCSP）水平不同的質粒DNA分別經(jīng)表皮或肌肉免疫注射BALB/c小鼠，結果表明，延長免疫間隔時間不僅可使抗體的產量增加，而且可增強免疫保護作用。而在經(jīng)表皮注射的動物中，發(fā)現(xiàn)該質粒DNA還可促進CSP特異性IgG同種型IgG1和IgG2a轉換，最終兩者達到平衡。用基因槍法將高表達質粒經(jīng)表皮3次免疫動物，每次間隔6周，結果誘導出強烈的體液免疫應答及高水平的保護作用。Gramzinski等[13]用編碼用PyCSP的質粒DNA免疫夜猴以進行優(yōu)化抗體應答方面的研究，結果表明，經(jīng)皮內途徑免疫誘導產生的抗體應答水平與多種抗原肽/佐劑疫苗相似。因此，在夜猴模型中，可應用皮內注射途徑進行DNA疫苗的初期研究。同時也表明，該途徑適合于誘導針對惡性瘧原蟲抗原的保護性應答的DNA疫苗研究。

　　3惡性瘧原蟲的核酸疫苗

　　惡性瘧原蟲子孢子表面蛋白2（PfSSP-2）是一種表達于子孢子及紅外期瘧原蟲膜表面的抗原，也是保護性免疫應答的一種靶抗原。在體內，過繼轉移PfSSP-2特異的CD8+T細胞可傳遞對攻擊感染的保護作用。用表達PfSSP-2的肥大細胞瘤細胞被動轉移也可傳遞來自CD8+T細胞的保護作用[14].

　　Wang等[15]將分別編碼惡性瘧原蟲PICSP、子孢子表面蛋白-2（PfSSP2）、紅外期蛋白（PfEXP2）及肝期蛋白-1（PfLSA1）基因的質粒DNA混合物或編碼單一蛋白基因的質粒DNA肌肉注射免疫恒河猴。如果，PfCSP質粒DNA免疫的所有6只猴、PfSSP2質粒DNA免疫的9只猴中的7只、PfEXP2或PfLSA1質粒DNA免疫的6只猴中的5只，它們的外周血單核細胞（PBMC）在體外經(jīng)抗原刺激均可檢測到抗原特異的CTL，且CTL活性受遺傳限制，并依賴于CD8+T細胞。本研究首次證明了質粒DNA混合物免疫的靈長類可誘導出針對混合物中所有組分的CD8+T細胞應答，可為人類的多核酸免疫提供基礎資料。

　　Butler等[16]報道了一項臨床試驗，用瘧原蟲CSP基因構建的核酸疫苗與佐劑QS21混合，接種免疫志愿者，結果7名經(jīng)感染有瘧原蟲的蚊反復叮咬的志愿者中，有6人獲得了保護，證實了核酸疫苗的免疫保護效果。

　　Wang等[17]用編碼瘧原蟲抗原蛋白的質粒DNA免疫注射瘧原蟲未感染的志愿者，結果表明，該疫苗可誘導出抗原特異的、基因限制的CD8+依賴的CTLs，且這種免疫應答受6個HLA1型等位基因的限制。本研究首次證明DNA疫苗可誘導未感染健康人產生CD8+CTLs.同時也證明在同一個體中，CTLs受多個HLA等位基因限制。這些證據(jù)將為這種革命性疫苗技術用于人體的進一步研究提供基礎資料。

　　4優(yōu)化瘧疾DNA疫苗的策略

　　4.1優(yōu)化免疫方案

　　核酸疫苗在誘導體液應答、CTL應答及保護作用的免疫途徑、劑量、次數(shù)及其間隔等仍未得到解決，但它們都可能影響核酸疫苗的免疫效果。正如Sedegah等[6]在PyCSPdNA疫苗免疫的試驗中，發(fā)現(xiàn)抗體的應答水平大約與質粒DNA劑量成正比，而且PyCSP質粒DNA疫苗經(jīng)2－3次免疫（間隔2－3周）可誘導出對子孢子攻擊感染的保護作用，若再進行第四次免疫，結果可引起Th1型免疫應答向Th2型免疫應答轉化。除上述影響因素外，研究還發(fā)現(xiàn)動物的發(fā)育程度也能影響疫苗的效果。Mor等[18]將具有保護作用的質粒DNA[6]用來免疫2－5日齡小鼠，發(fā)現(xiàn)它們不僅不能誘導免疫效應，反而誘導了免疫耐受。這種新生期免疫耐受的動物體內經(jīng)DNA疫苗再次免疫無法誘導出抗體、細胞因子或細胞毒應答。這種耐受特異針對由核酸疫苗編碼表達的內源性抗原的免疫原表位，而經(jīng)外源CSP免疫的小鼠可產生針對不同表位的抗體，而不發(fā)生免疫耐受。這些結果表明，與傳統(tǒng)的蛋白免疫原相比，DNA疫苗誘發(fā)的免疫應答在性質、特異性方面有著明顯的差異。

　　4.2改善DNA疫苗的載體

　　DNA疫苗研究的最終目的在于利用它來保護人體以抵抗瘧原蟲感染，因此安全性顯得非常重要。為避免外源基因整合進人體細胞染色體中，研究人員在構建載體時將一些病毒DNA序列如SV40的復制起始點剔除掉。同時也可插入一些有利于靶抗原基因表達的序列，如Haddad等[19]構建了可編碼瘧疾抗原Pf322的質粒DNA，同進在此質粒DNA中編碼靶抗原基因的前方插入人體組織纖溶酶激活物（tPA）信號序列。首先在體外分別用含有或缺乏tPA信號序列的質粒DNA轉染COS細胞，并用布雷菲爾德菌素A處理轉染子。結果表明，只有編碼有信號肽的質粒轉染的細胞通過質內網(wǎng)和Golgi體通路分泌靶抗原。分別用這種質粒重復肌肉注射小鼠，結果誘發(fā)的針對靶抗原的抗體應答在動力學、特異性IgG水平及持續(xù)時間上都有明顯的區(qū)別，這些結果提示，這兩種質粒體內轉染肌肉細胞產生的B細胞可識別及抗原提呈細胞（APC）可攝取的靶抗原水平也明顯不同。

　　4.3修飾抗原序列以改變抗原表達的定位及免疫原性

　　改變DNA疫苗抗原表達的定位可用于改變該抗原的免疫原性。現(xiàn)代免疫學研究已經(jīng)證明，非分泌性抗原必須通過MHCⅠ類途徑優(yōu)先處理和提呈才能激發(fā)CD8+T細胞介導的免疫應答，而分泌性抗原只能通過促進APC攝取以及MHCⅡ類途徑提呈從而誘發(fā)體液應答。另外，也可通過改變抗原的氨基酸序列改變抗原免疫原性[20].

　　4.4免疫應答的改變

　　優(yōu)化免疫應答可通過如下方法進行，應用編碼有細胞因子或協(xié)同刺激因子的質粒來調控免疫應答。Weiss等[21]分別構建了編碼PyCSP基因的質粒DNA——PyCSP1012和鼠CM-CSF基因的質粒DNA.結果發(fā)現(xiàn)，單獨以PyCSP1012免疫小鼠，其保護率為28%；與GM-CSF質粒DNA同時免疫則保護率可提高到58%；與編碼無活性的GM-CSF的質粒DNA同時免疫則不能提高其保護性；而GM-CSF質粒DNA單獨免疫也沒有保護性。GM-CSF質粒DNA在PyCSP1012免疫中的免疫促進作用表現(xiàn)為，它可提高PyCSP的IgG1、IgG2a及IgG2b的產量，而不能促進IgG3或IgM的產生；同時它也可增強CD8+T細胞針對PyCSP280－288aa表位的IFN-γ應答增強，但CTL活性沒有發(fā)生變化。最引人注目的是，PyCSP1012質粒DNA和GM-CSF質粒DNA同時免疫可提高抗原特異的IL-2的產量，并促進抗原特異CD4+T細胞的增生，提示GM-CSF質粒DNA可能作用于樹突狀細胞進而促進PyCSP抗原的提呈，然后IL-2產量的增加及CD4+T細胞活性增強促進了抗體和CD8+T細胞的功能。重組GM-CSF已應用于人體的臨床治療，因而GM-CSF蛋白或其質粒DNA可用作DNA免疫的一種增強劑。

　　5結語

　　DNA免疫技術為瘧疾疫苗的研制開拓了一條前所未有的新途徑。自此項技術應用于瘧疾核酸疫苗的研制后，在短短的幾年間，已有多種DNA疫苗使用于動物模型的研究，并可誘導出CD8+T細胞應答。研究表明，用二價DNA疫苗或多價疫苗或多種單價疫苗聯(lián)合免疫有可能克服遠交系動物因遺傳背景而限制的免疫應答。盡管如此，在設計與構建能誘導保護性免疫應答的核酸疫苗方面尚存在許多問題。從瘧疾基因組計劃[22]可獲得許多基因的信息，并很快在DNA疫苗研制中得到了應用。另外，應用基因技術可從基因庫中鑒定并篩選出可編碼保護性抗原的基因[23]，也將有利于瘧疾疫苗的研制。

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