1. 引言

成體干細(xì)胞是指存在于成年機(jī)體組織器官中的具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)多種成體組織中都存在著干細(xì)胞[1]，早在1987 年，McCulloch[2]即提出牙周韌帶中可能存在有前體細(xì)胞，這些細(xì)胞可能源自骨髓基質(zhì)，通過血管通道進(jìn)入牙周韌帶，定位于牙周韌帶血管周圍及骨韌帶間隙。到2004 年，Seo BM等人[3] 成功的從人的阻生牙上分離出PDLSC，他們首先對(duì)其橫向分化潛能和表型作了研究，證明它具有多向分化的干細(xì)胞特點(diǎn)，同時(shí)將細(xì)胞與羥基磷灰石/磷酸三鈣（HA-TCP）粉混合植入免疫缺陷小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)能夠形成牙周韌帶牙骨質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)，并首次提出了牙周干細(xì)胞的概念，表明了牙周韌帶干細(xì)胞的潛能。

我們對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)，并進(jìn)行礦化。局部微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化起關(guān)鍵性作用。在體外，培養(yǎng)條件則成為調(diào)控細(xì)胞分化方向的關(guān)鍵，國內(nèi)外研究均表明干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)液的作用下能夠多向分化[4， 5].礦化液是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化的有效途徑。對(duì)于牙周韌帶干細(xì)胞礦化誘導(dǎo)前后的變化，是本實(shí)驗(yàn)將要探討的問題。

2. 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)用品

2.1.1 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)試劑、儀器、免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒同前。礦化液為含10%胎牛血清，10－6M地塞米松，50μg/ml α-抗壞血酸（ascorbic acid） （Amesco，USA），10mM β-甘油磷酸鈉（β-glycerophyosphate，β-GP） （Sigma，USA）的DMEM.BSP 抗體（NIDCR LW.Fisher 博士惠贈(zèng) ）；ALP 活性檢測(cè)試劑盒（南京建成）；其余試劑均為分析純。以正常牙周韌帶細(xì)胞作為對(duì)照組。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)用液的配制

β-甘油磷酸鈉： 取2.16g 溶于10m1 三蒸水。配成1 mol/L（100 x）的貯備液濃度。0.2μm 濾膜過濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。地塞米松及其貯備液配制： 配成1 mol/L 的貯備液濃度。0.2μm 濾膜過濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?

2.2 方法

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和克隆分離

參照Seo的方法[3]，采用膠原酶和disPase酶聯(lián)合消化法進(jìn)行牙周韌帶干細(xì)胞的原代培養(yǎng)。具體簡述如下：組織塊法：取臨床上10-15 歲因正畸而拔除的無齲病和牙周病的前磨牙，刮取牙根中1/3 處的牙周膜，剪成1mm2 大小的組織塊，均勻地鋪于培養(yǎng)瓶底，加入1mlDMEM培養(yǎng)液， 孵育4 小時(shí)，待組織塊貼牢瓶底后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。每3 天換液一次，直至細(xì)胞從組織塊周圍游出、待細(xì)胞匯合后用0.25%胰蛋白酶消化。酶消化法：同上法取組織塊，用3mg/ml的I型膠原酶和4mg/ml的Dispase酶在37oC消化lh，輕輕吹打離散單細(xì)胞團(tuán)塊， 100μm的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，800 r.p.m離心5 min，重懸，以1 x 105/ml的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置5%CO2、飽和濕度的37oC恒溫孵箱中培養(yǎng)。72h后首次換液，以后每3天換液l次。每日在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞生長達(dá)80%～90%匯合時(shí)，胰酶消化傳代。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，調(diào)整后以1-2 個(gè)細(xì)胞／孔的濃度接種于96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)7-14 天，至出現(xiàn)細(xì)胞克隆（細(xì)胞數(shù)≥50 為判定標(biāo)準(zhǔn)）后胰酶消化，逐步分別擴(kuò)大培養(yǎng)，常規(guī)傳代或凍存。

2.2.2 礦化誘導(dǎo)和VonKossa 染色

制備第3 代人牙周韌帶干細(xì)胞及牙周韌帶細(xì)胞懸液，以1×106cells /ml 的密度接種于6孔板，礦化液連續(xù)培養(yǎng)14 天，中止培養(yǎng)，0.01M 冷PBS 沖洗三遍，4%中性福爾馬林固定后進(jìn)行Von Kossa 染色，觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況，步驟依次為：5%硝酸銀染色，紫外燈下照射10～15 min，去離子水洗20 min，5%亞硫酸鈉還原1 min，1%中性紅襯染，常規(guī)脫水封片，光鏡觀察。

2.2.3 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)

將兩種細(xì)胞接種于24 孔板，礦化液連續(xù)培養(yǎng)14 天，棄去礦化液，0.01M 冷PBS 沖洗三遍，每孔加入細(xì)胞裂解液200μl，室溫振蕩10min，收集上清液，檢測(cè)細(xì)胞的ALP 活性。用Lawry 法測(cè)蛋白含量，結(jié)果以ALP 活性/每克蛋白表示。

2.2.4 免疫組化檢測(cè)骨唾蛋白表達(dá)

將兩種細(xì)胞接種于6 孔板，礦化液連續(xù)培養(yǎng)14 天，中止培養(yǎng)，4%中性福爾馬林固定后常規(guī)免疫組化檢測(cè)骨唾蛋白表達(dá)。

3. 結(jié)果

3.1 礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果

克隆來源細(xì)胞用礦化液連續(xù)培養(yǎng) 14 天后，肉眼觀可見白色點(diǎn)狀物，倒置顯微鏡下細(xì)胞呈復(fù)層生長，局部形成白色的礦化結(jié)節(jié)，Von Kossa 染色顯示其染成褐紅色的大小不等的礦化結(jié)節(jié)，周邊細(xì)胞界限不清，中央?yún)^(qū)為紅黑色，周圍逐漸變淺。對(duì)照組細(xì)胞雖然形成細(xì)胞結(jié)節(jié)，但Von Kossa 染色陰性。

3.2 ALP 活性檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞經(jīng)14 天礦化液誘導(dǎo)培養(yǎng)后，其ALP 活性與礦化結(jié)節(jié)的形成能力一致。t 檢驗(yàn)結(jié)果表明克隆來源細(xì)胞的ALP 活性明顯高于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05）。

3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

誘導(dǎo)前細(xì)胞抗BSP 染色為陰性，誘導(dǎo)后抗BSP 染色呈陽性，對(duì)照組誘導(dǎo)后抗BSP 染色呈陰性。

4. 討論

牙周組織中包含著兩種礦化組織[6]：骨和牙骨質(zhì)，盡管這兩種硬組織的礦化機(jī)制及礦化程度不盡相同，但它們的基本成分十分類似。兩者的礦化成分都主要為羥基磷灰石和無定型磷酸鈣，而礦化基質(zhì)大部分為I型膠原和少量的非膠原蛋白。兩者的非膠原蛋白成分也大體相同，主要有骨鈣素（osteocalcin OCN）、骨橋素（osteopontin OPN）、及骨睡液蛋白（bonesialoprotein BSP）等。同時(shí)，形成兩種礦化組織的成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞也有相似之處，不僅都具有體外礦化的能力，對(duì)不同信號(hào)因子的反應(yīng)也極為類似。因此，區(qū)別兩種細(xì)胞具有一定難度醫(yī)`學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。

骨唾蛋白（Bone sialoprotein）是一種高度糖基化和硫酸化的磷蛋白，是骨基質(zhì)的主要非膠原蛋白之一，是礦化組織特異性蛋白[7]，雖然在無細(xì)胞牙骨質(zhì)和細(xì)胞牙骨質(zhì)中也有表達(dá)，但其在成熟的骨形成細(xì)胞中表達(dá)更明顯，因此是成骨細(xì)胞分化的晚期標(biāo)志。本研究免疫組化結(jié)果顯示骨唾蛋白大量表達(dá)，也說明了PDLSCs具有向成骨細(xì)胞分化的能力。堿性磷酸酶（ALP）是一種較為肯定的參與促進(jìn)鈣化活動(dòng)的酶類。但是，目前關(guān)于ALP在牙骨質(zhì)的表達(dá)還是個(gè)有爭議的問題[8].但ALP在骨細(xì)胞中的表達(dá)是毫無疑問的，因此，我們把ALP看作是PDLSCs分化為骨形成細(xì)胞的標(biāo)志。在本實(shí)驗(yàn)中，礦化誘導(dǎo)后的克隆組細(xì)胞ALP活性明顯高于對(duì)照組，說明PDLSCs分化為成骨細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)大，并具有成骨的潛在能力。礦化結(jié)節(jié)的大量形成也說明了這一點(diǎn)。