本章重點:

　　掌握：DNA克隆概念，限制性內切酶的定義及其特點，基因載體的種類。重組DNA技術的基本過程，目的基因獲取的方法，外源基因與載體的連接方式，重組DNA分子導入受體菌的方式，重組體篩選的方法。

　　熟悉：基因組DNA文庫和cDNA文庫的概念，目的基因表達體系的種類及其特點

　　了解：自然界基因轉移的方式：接合作用、轉化及轉導作用、轉座；重組有兩種類型，即位點特異性的重組和同源重組

　　本章難點

　　兩種類型基因重組的機理；限制性內切酶的作用特點，基因載體的種類；重組DNA技術的基本環(huán)節(jié)中，目的基因的獲取方法，外源基因與載體連接的方法，重組DNA導入受體菌的方法，重組體的篩選方法，以及原核和真核表達體系的優(yōu)缺點比較

　　基本要點

　　一、自然界的基因轉移和重組

　　自然界不同物種或個體之間的基因轉移和重組是經常發(fā)生的，它是基因變異和物種進化的基礎。自然界的基因轉移的方式有：

　　接合作用：當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA 就可從一個細胞(細菌)轉移至另一細胞(細菌)，這種類型的DNA轉移稱為接合作用(conjugation )。

　　轉化作用(transformation) 通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型。

　　轉導作用：當病毒從被感染的(供體)細胞釋放出來、再次感染另一(受體)細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用(transduction)。

　　轉座：大多數(shù)基因在基因組內的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的DNA 序列包括插入序列和轉座子。由插人序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座(transposition )。

　　基因重組：在接合、轉化、轉導或轉座過程中，不同DNA分子間發(fā)生的共價連接稱基因重組。基因重組包括位點特異性的重組和同源重組兩種類型。有整合酶催化的在兩個DNA序列特異位點間發(fā)生的整合，產生位點特異的重組。特異重組依賴特異的DNA序列，如λ噬菌體的整和酶可識別噬菌體DNA和宿主染色體的特異靶位點，并進行選擇性整合；反轉錄病毒整合酶識別整合反轉錄病毒cDNA的長末端重復序列等。另外有發(fā)生在同源序列間的同源重組，又稱基本重組。同源重組依賴兩分子間序列的相同或相似性，將外源DNA整合進宿主染色體。

　　二、重組DNA技術相關概念

　　1．DNA克隆(DNA cloning) 就是應用酶學的方法，在體外把目的基因與載體DNA結合成具有自我復制能力的DNA分子一一復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆。由于早期研究是從較大的染色體分離、擴增特異性基因，因此DNA克隆又稱基因克隆(gene cloning )。

　　2．工具酶 在重組DNA技術即基因工程技術中需應用某些基本酶類進行基因操作，稱為工具酶。常用的工具酶包括如DNA聚合酶Ⅰ、DNA連接酶、末端轉移酶、反轉錄酶、多聚核苷酸激酶，而限制性核酸內切酶特別重要，應用最廣。

　　限制性內切核酸酶(restriction endonuclease) 是能夠識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。限制性內切核酸酶存在于細菌體內，與相伴存在的甲基化酶共同構成細菌的限制－修飾體系，限制外源DNA、保護自身DNA，對細菌遺傳性狀的穩(wěn)定遺傳具有重要意義。目前發(fā)現(xiàn)的限制性內切核酸酶有1800種以上。限制性內切核酸酶分為三類。重組DNA技術中常用的限制性內切核酸酶為Ⅱ類酶，例如，EcoRI、BamH I等就屬于這類酶。大部分Ⅱ類酶識別DNA位點的核苷酸序列呈二元旋轉對稱，通常稱這種特殊的結構順序為回文結構(Palindrome)。所有限制性內切核酸酶切割DNA均產生含5'磷酸基和3'羥基基團的末端。限制性內切核酸酶的特點：①識別DNA的特異序列并切割；②不同的酶識別核苷酸序列往往包含4個到6個核苷酸；③不同的酶切割DNA頻率不同；④可產生粘性或鈍性未端；帶有相同類型的粘性末端或鈍性末端的DNA都可以再相互連接。

　　3．目的基因 基因工程中常為分離、獲得某一感興趣的基因或DNA序列，或為得到感興趣的基因的蛋白質表達產物，這種感興趣的基因或DNA序列稱為目的基因。目的基因可來自cDNA和基因組DNA，cDNA(complementary DNA )是指以mRNA或病毒RNA經反轉錄酶催化合成互補單鏈DNA，再聚合生成的雙鏈cDNA；基因組DNA(genomic DNA)則指代表一個細胞或生物體全套遺傳信息的所有DNA 序列。

　　4．基因載體 基因載體也稱克隆載體，是指用以攜帶外源目的基因，實現(xiàn)外源DNA克隆及表達為有意義蛋白質而利用的DNA分子。能使插入的外源DNA序列可被轉錄并翻譯成多肽鏈而專門設計的基因載體又稱表達載體。常用基因載體包括質粒、噬菌體、病毒DNA等。理想載體有獨立復制能力，能夠利用宿主酶系轉錄和翻譯，有多種限制性內切酶單一切口及一定篩選標記，如質粒的抗藥性基因

　?。?）質粒(plasmid) 存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。能在宿主細胞獨立自主地進行復制，會賦予宿主細胞一些遺傳性狀，如對抗生素或重金屬的抗性等。質粒賦予細菌的表型可識別質粒的存在，是篩選轉化子細菌的根據(jù)。

　?。?）噬菌體DNA 常用作基因載體的噬菌體DNA有λ噬菌體、M13噬菌體，經M13噬菌體改造的載體含不同位置的克隆位點，可接受不同限制性內切酶切片段。

　?。?）另外還有可插入大片段外源基因的柯斯質粒載體、酵母人工染色體載體，用于真核基因表達的腺病毒載體和逆轉錄病毒載體等。

　　三、重組DNA技術基本原理

　　DNA克隆過程包括:目的基因的獲取，基因載體的選擇與構建，目的基因與載體的拼接，重組DNA分子導人受體細胞，篩選并無性繁殖含重組分子的受體細胞(轉化子)。

　　目的基因的獲取常用的方法：化學合成法、基因組DNA文庫、cDNA文庫 聚合酶鏈反應

　　克隆載體的選擇和構建：將外源DNA連到復制子上，外源DNA則可作為復制子的一部分在受體細胞中復制。這種復制子就是克隆載體。

　　外源基因與載體的連接：粘性末端連接包括同一限制酶切割位點連接和不同限制性內切酶位點連接；平端連接；同聚物加尾連接；人工接頭連接。

　　重組DNA導入受體菌：導入重組DNA分子的方法有轉化(transformation)、轉染(transfectim)和感染(infection)等。受體細胞為細菌時，常采用電穿擊法、熱擊法等。

　　重組體的篩選：根據(jù)載體體系、宿主細胞特性及外源基因在受體細胞表達情況不同，可采取直接選擇法和非直接選擇法。直接選擇法，指對載體攜帶某種或某些標志基因和目的基因而設計的篩選方法，其特點是直接測定基因或基因表型；抗藥性標志選擇，標志補救，分子雜交法； 免疫學方法不是直接鑒定基因，而是利用特異抗體與目的基因表達產物相互作用進行篩選，因此屬非直接選擇法。免疫學方法特異性強、靈敏度高，尤其適用于選擇不為宿主菌提供任何選擇標志的基因。免疫學方法又可根據(jù)具體基因選擇操作過程不同，分為免疫化學方法及酶免檢測分析等。

　　克隆基因的表達：目的基因的表達體系的建立包括表達載體的構建、受體細胞的建立及表達產物的分離、純化等技術和策略。表達體系包括原核表達體系和真核表達體系兩類。E. coli是當前采用最多的原核表達體系，其優(yōu)點是培養(yǎng)方法單、迅速、經濟而又適合大規(guī)模生產工藝，人們運用E.coli表達外源基因已有20多年的經驗。在實際工作中，根據(jù)表達的基因不同，選擇不同的表達策略。E.coli表達體系在實際應用中尚有一些不足之處：①由于缺乏轉錄后加工機制；②由于缺乏適當?shù)姆g后加工機制；③表達的蛋白質常常形成不溶性的包涵體，欲使其具有活性尚需進行復雜的復性處理；④很難在Ecol表達體系表達大量的可溶性蛋白。真核表達體系如酵母、昆蟲及哺乳類動物細胞表達體系顯示了較大優(yōu)越性。尤其是哺乳類動物細胞，不僅可表達克隆的cDNA，而且還可表達真核基因組DNA；哺乳類細胞表達的蛋白質通?？偸潜贿m當修飾，而且表達的蛋白質會恰當?shù)胤植荚诩毎麅纫欢▍^(qū)域并積累。哺乳類動物細胞表達體系的缺點是操作技術難、費時、不經濟。常用于細胞轉染的方法有：磷酸鈣轉染、DEAE葡聚糖介導轉染、電穿孔、脂質體轉染及顯微注射等。當前采用最多的哺乳類細胞是COS細胞(猿個猴腎細胞)和CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)。

　　四、重組DNA技術與醫(yī)學的關系

　　1990年，分子醫(yī)學(molecular medicine )的誕生及其在近幾年的發(fā)展正是重組DNA技術與醫(yī)學實踐相結合的結果。分子醫(yī)學包含的領域及內容概括如下幾個方面。

　　1．疾病基因的發(fā)現(xiàn) 重組DNA技術的應用使分子遺傳學家有可能根據(jù)基因定位，而不是它的功能來克隆一個基因。根據(jù)克隆基因的定位和性質研究所提供的線索，可進一步確定克隆的基因在分子遺傳病中的作用。因此，一個疾病相關基因的發(fā)現(xiàn)不僅可導致新的遺傳病的發(fā)制圖或定位，并掌握其全部序列信息，人類則完全可能通過對候選基因的控制和改造，從根本上治療和防止遺傳病的發(fā)生和流行。

　　2．發(fā)展生物制藥 利用重組DNA技術生產有藥用價值的蛋白質、多肽產品已成為當今世界一項重大產業(yè)。重組蛋白質藥物生產是在功能研究、基因克隆基礎上，構建適當?shù)谋磉_體系表達有生物活性的蛋白質、多肽；再經過科學的動物實驗、嚴格的臨床試驗和藥物審查，發(fā)展為新藥物。

　　3．遺傳病的預防 受累疾病基因克隆不僅為醫(yī)學家提供了重要工具，使他們能深入地認識、理解一種遺傳病的發(fā)生機制，為尋求可能的治療途徑、預測療效提供了有力手段；更重要的是，利用這些成果進行極有意義的產前診斷和癥候前診斷，而后通過診斷技巧與治療、預防能力的結合，從根本上杜絕遺傳性疾病的發(fā)生和流行。預防方法包括：產前診斷、攜帶者測試、癥候前診斷、遺傳病易感性分析。