前言

　　結(jié)合（以蛋白為載體的細(xì)菌多糖類(lèi)）疫苗是指采用化學(xué)方法將多糖共價(jià)結(jié)合在蛋白載體上所制備成的多糖-蛋白結(jié)合疫苗，用于提高細(xì)菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗等。結(jié)合疫苗的生產(chǎn)及質(zhì)量控制應(yīng)符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定和中國(guó)藥品GMP要求。其制造及檢定方法的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范、驗(yàn)證和修訂應(yīng)獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)或認(rèn)可。

　　本原則適用于多糖-蛋白結(jié)合疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制和臨床研究。

　　應(yīng)根據(jù)疫苗生產(chǎn)用菌種的生物安全防護(hù)等級(jí)分類(lèi)，在相應(yīng)的生物安全防護(hù)條件下進(jìn)行各項(xiàng)生產(chǎn)用菌種的操作。生產(chǎn)操作和質(zhì)量檢驗(yàn)人員必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的職業(yè)培訓(xùn)，并應(yīng)采取適宜的防護(hù)措施，例如免疫接種相應(yīng)的疫苗。必須制訂詳細(xì)的和切實(shí)可行的緊急處理措施，確保一旦發(fā)生細(xì)菌溢出、滲漏等其它細(xì)菌播散事故時(shí)，可最大限度地控制和避免危害人身和環(huán)境的安全。

　　一、結(jié)合疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制原則

　　（一）多糖抗原生產(chǎn)的質(zhì)量控制

　　1.生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基：生產(chǎn)用菌種須經(jīng)國(guó)家食品藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)方可用于制備多糖抗原。應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。從原始種子批傳代、擴(kuò)增后凍干保存為主種子批。從主種子批制備工作種子批。主種子批和工作種子批菌種的各種特性應(yīng)與原始種子批一致。工作種子批用于生產(chǎn)。應(yīng)驗(yàn)明各級(jí)菌種庫(kù)菌種的記錄、來(lái)源、歷史和生物學(xué)特性，并進(jìn)行各項(xiàng)必需的生物學(xué)特性鑒定。如：形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)和血清學(xué)試驗(yàn)等。必要時(shí)可采用核磁共振（1H或13C）、核苷酸序列分析等特殊鑒定方法。

　　培養(yǎng)基成分應(yīng)盡可能避免使用動(dòng)物源性材料，禁止使用來(lái)自瘋牛病疫區(qū)的牛源性材料。

　　應(yīng)通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)速度、pH值和多糖的產(chǎn)量，保證不同批或不同培養(yǎng)罐中細(xì)菌生長(zhǎng)的均一性。

　　應(yīng)在培養(yǎng)過(guò)程中及殺菌前取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，可采用革蘭氏染色鏡檢和平皿劃線接種培養(yǎng)等。若發(fā)現(xiàn)染有雜菌應(yīng)廢棄。

　　2.精制純化多糖：精制純化多糖應(yīng)逐批進(jìn)行鑒別試驗(yàn)、純度和分子大小測(cè)定。應(yīng)制定多糖純度的合格標(biāo)準(zhǔn)。通常應(yīng)在－20℃以下儲(chǔ)存精制純化后的多糖，以維持其穩(wěn)定性。為控制精制純化多糖的質(zhì)量所進(jìn)行的測(cè)定包括：

　?。?）鑒別試驗(yàn)：通常應(yīng)用血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行多糖鑒別試驗(yàn)；

　?。?）分子大小分布：應(yīng)采用凝膠過(guò)濾或高效液相色譜（HPLC）等適宜方法測(cè)定純化多糖的分子大小分布，并建立相應(yīng)的KD值合格標(biāo)準(zhǔn)，不同批純化多糖的KD值應(yīng)保持一致；

　?。?）采用凍干保存的純化多糖，其水分含量應(yīng)合格；

　?。?）多糖含量：應(yīng)采用特定的方法測(cè)定糖含量，如磷含量測(cè)定、唾液酸含量測(cè)定和核糖含量測(cè)定等方法；

　?。?）雜蛋白含量：應(yīng)采用Lowry法、BCA法等方法測(cè)定純化多糖中蛋白雜質(zhì)的含量，應(yīng)同時(shí)采用相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品作蛋白測(cè)定對(duì)照；

　?。?）核酸雜質(zhì)含量：應(yīng)采用紫外260nm測(cè)定等方法測(cè)定純化多糖中核酸雜質(zhì)含量；

　?。?）應(yīng)采用家兔熱原試驗(yàn)或鱟試驗(yàn)定量測(cè)定方法測(cè)定純化多糖中的熱原質(zhì)及內(nèi)毒素含量；

　　3.修飾處理后的多糖：多糖與載體蛋白結(jié)合前通常需先經(jīng)化學(xué)修飾，即活化（例如可采用溴化氰活化多糖）。應(yīng)采用適宜的方法檢測(cè)化學(xué)修飾的效果，即活化度測(cè)定；另外，可采用凝膠過(guò)濾或高效液相色譜等適宜方法測(cè)定活化后多糖的分子大小分布，以確保多糖－蛋白結(jié)合反應(yīng)的批間一致性。

　?。ǘ┹d體蛋白的質(zhì)量控制

　　載體蛋白生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基的質(zhì)控原則與多糖抗原生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基的質(zhì)控原則相同。

　　結(jié)合疫苗常用的載體蛋白包括有：破傷風(fēng)類(lèi)毒素、白喉毒素?zé)o毒變異蛋白（CRM197）和B群腦膜炎球菌外膜蛋白等。

　　如果采用已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的破傷風(fēng)類(lèi)毒素和白喉類(lèi)毒素等作為載體，其各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的要求，尤其要注意確保載體蛋白的純度。

　　采用國(guó)外已通過(guò)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證的安全有效的CRM197蛋白、B群腦膜炎球菌外膜蛋白等作為載體，應(yīng)參照國(guó)外相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其特性和純度進(jìn)行質(zhì)量復(fù)核：（1）可采用HPLC法等適宜方法測(cè)定CRM197蛋白的純度，其純度應(yīng)在90%以上；應(yīng)確保CRM197蛋白的氨基酸序列正確無(wú)誤。如果與白喉類(lèi)毒素在同一車(chē)間生產(chǎn)，應(yīng)建立能區(qū)分CRM197蛋白和白喉毒素的方法，并應(yīng)符合中國(guó)藥品GMP要求。（2）可采用SDS-PAGE圖譜分析測(cè)定純化后B群腦膜炎球菌外膜蛋白復(fù)合物的組成；其脂多糖的含量不應(yīng)超過(guò)8%；家兔熱原試驗(yàn)應(yīng)合格。

　　采用上述以外的其它蛋白作為載體，應(yīng)參照上述蛋白載體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，結(jié)合其自身特點(diǎn)建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)和復(fù)核。

　　可采用血清學(xué)方法進(jìn)行載體蛋白的鑒別試驗(yàn)。用于檢測(cè)載體蛋白理化特性的常用方法包括：SDS-PAGE圖譜分析、等電聚焦分析、HPLC測(cè)定、氨基酸分析、氨基酸序列分析、旋光度測(cè)定、熒光分光光譜分析、肽圖譜分析和質(zhì)譜分析等。

　　如果載體蛋白與多糖結(jié)合前需進(jìn)行活化處理，應(yīng)建立測(cè)定蛋白活化程度的方法，以確保批與批之間的一致性。

　　（三）多糖-蛋白結(jié)合物原液的質(zhì)量控制

　　不同的結(jié)合疫苗可能采用不同的多糖-蛋白結(jié)合工藝，但均需要進(jìn)行多步反應(yīng)。為了確保多糖-蛋白結(jié)合物的穩(wěn)定性、安全性和批間一致性，應(yīng)建立相應(yīng)的質(zhì)量控制方法。由于結(jié)合反應(yīng)可能影響多糖的結(jié)構(gòu)，多糖-蛋白結(jié)合后（單價(jià)結(jié)合物未混合前）應(yīng)進(jìn)行多糖的鑒別試驗(yàn)。此外，還應(yīng)對(duì)純化后的多糖-蛋白結(jié)合物進(jìn)行以下檢測(cè)：

　　1.應(yīng)采用適宜的檢測(cè)方法，確證多糖-蛋白結(jié)合物原液經(jīng)過(guò)純化后，多糖-蛋白結(jié)合反應(yīng)中所使用的試劑（如溴化氰、ADH和EDAC等化學(xué)試劑）已被清除；

　　2.如果化學(xué)結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生了獨(dú)特的結(jié)合標(biāo)志（例如某一獨(dú)特的氨基酸），可通過(guò)測(cè)定該標(biāo)志物定量分析多糖—蛋白結(jié)合反應(yīng)的程度，也可將結(jié)合物中多糖/蛋白比作為判斷結(jié)合反應(yīng)的一個(gè)間接標(biāo)志；

　　3.殘留的活化功能基團(tuán)：結(jié)合物中多糖或載體蛋白均應(yīng)不再殘留有活化后未結(jié)合的功能基團(tuán)；

　　4.結(jié)合及未被結(jié)合的多糖含量：結(jié)合多糖為結(jié)合疫苗中的免疫保護(hù)抗原。未被結(jié)合的游離多糖不得超過(guò)一定比例?？芍苯訙y(cè)定游離多糖的含量，或先將結(jié)合多糖和未結(jié)合多糖分離后測(cè)定結(jié)合多糖的含量。將結(jié)合多糖和游離多糖分離的方法包括沉淀、凝膠過(guò)濾、超濾或超離等方法；

　　5.蛋白含量：可采用HPLC等適宜方法測(cè)定多糖-蛋白結(jié)合物中結(jié)合蛋白和未結(jié)合蛋白的含量；

　　6.多糖/蛋白比：分別測(cè)定結(jié)合物中結(jié)合多糖和結(jié)合蛋白的含量；

　　7.分子大小分布：結(jié)合物原液應(yīng)逐批進(jìn)行相對(duì)分子大小的測(cè)定，可采用凝膠過(guò)濾或液相色譜等方法進(jìn)行測(cè)定，所建立的方法應(yīng)能將多糖-蛋白結(jié)合物與未結(jié)合的多糖、蛋白區(qū)分開(kāi)；

　　8.無(wú)菌試驗(yàn)應(yīng)合格；

　　9.結(jié)合物中載體蛋白的毒性試驗(yàn)：如果采用破傷風(fēng)類(lèi)毒素和白喉類(lèi)毒素作為載體蛋白，應(yīng)按現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的要求，對(duì)多糖-蛋白結(jié)合物進(jìn)行破傷風(fēng)類(lèi)毒素和白喉類(lèi)毒素的毒性試驗(yàn)；

　　10.可對(duì)結(jié)合物進(jìn)行熱原試驗(yàn)及內(nèi)毒素含量測(cè)定。

　　疫苗原液在稀釋、分裝前可加入適宜和適量的佐劑、防腐劑及保護(hù)劑。多價(jià)結(jié)合疫苗既可在各單價(jià)結(jié)合物原液混合后加入佐劑、防腐劑及保護(hù)劑，也可在各單價(jià)結(jié)合物原液中加入佐劑、防腐劑及保護(hù)劑后再混合。稀釋分裝前無(wú)菌試驗(yàn)應(yīng)合格。

　?。ㄎ澹┏善返馁|(zhì)量檢定

　　1.鑒別試驗(yàn)：通常采用多糖的特異性抗體進(jìn)行免疫學(xué)測(cè)定；

　　2.無(wú)菌試驗(yàn)：成品中不得檢出細(xì)菌或真菌等微生物；

　　3.多糖含量：可采用化學(xué)顯色、色譜分析（包括HPLC）或符合國(guó)家規(guī)定的免疫學(xué)方法（例如速率比濁法或ELISA）進(jìn)行測(cè)定；

　　4.殘留水分：如果結(jié)合疫苗為凍干制品，應(yīng)采用適宜方法測(cè)定水分，殘余水分應(yīng)不超

　　5.毒素含量：可采用家兔熱原試驗(yàn)或鱟試驗(yàn)定量測(cè)定內(nèi)毒素含量；

　　6.佐劑含量：如果疫苗使用了佐劑，應(yīng)采用適宜的方法檢測(cè)成品中佐劑的含量，所使用的佐劑及其用量應(yīng)符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定。如果所使用的佐劑為鋁佐劑，每人用劑量中的佐劑含量應(yīng)不超過(guò)1.25mg；

　　7.防腐劑含量：選擇防腐劑時(shí)應(yīng)該考慮防腐劑的穩(wěn)定性，應(yīng)避免選擇可能與疫苗成分產(chǎn)生相互作用的防腐劑。如果疫苗中加入了防腐劑，應(yīng)采用符合國(guó)家規(guī)定的方法測(cè)定成品中防腐劑的含量。所加入的防腐劑及其含量應(yīng)符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定，即應(yīng)不破壞疫苗的免疫效果，也不會(huì)損害人體健康；

　　8.異常毒性試驗(yàn)，應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的要求；

　　9.pH值測(cè)定：pH值對(duì)結(jié)合疫苗的穩(wěn)定性、安全性及免疫保護(hù)效果影響很大，應(yīng)根據(jù)臨床研究和穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果確定最適pH值范圍。成品應(yīng)逐批進(jìn)行pH值測(cè)定，凍干制品應(yīng)采用批準(zhǔn)的稀釋劑復(fù)溶后進(jìn)行pH值測(cè)定；

　　10.外觀檢查應(yīng)符合規(guī)定要求；

　　11.稀釋劑：應(yīng)對(duì)復(fù)溶疫苗用稀釋劑進(jìn)行檢定。必須采用疫苗生產(chǎn)廠家提供的、符合國(guó)家規(guī)定的稀釋劑。

　　（六）其他

　　結(jié)合疫苗的包裝、標(biāo)簽、配送、運(yùn)輸和儲(chǔ)存均應(yīng)符合中國(guó)藥品GMP要求及國(guó)家有關(guān)規(guī)定。

　　結(jié)合疫苗的標(biāo)簽上應(yīng)標(biāo)明：每一人用劑量中所含多糖抗原（血清群、型別）和載體蛋白；每一人用劑量中每一結(jié)合物的含量；儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)倪m宜溫度（2-8℃）；如果疫苗為凍干疫苗，應(yīng)標(biāo)明疫苗復(fù)溶后應(yīng)迅速接種；凍干疫苗應(yīng)標(biāo)明疫苗復(fù)溶所采用的稀釋劑名稱(chēng)及體積。穩(wěn)定性試驗(yàn)應(yīng)考慮的因素包括：結(jié)合疫苗逐漸解聚的特性，導(dǎo)致多糖分子量變小、與蛋白載體結(jié)合的多糖含量減少、結(jié)合物分子變小以及游離多糖含量增加。加速穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果不能替代實(shí)時(shí)穩(wěn)定性試驗(yàn)。如果生產(chǎn)工藝的改變可能影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性，應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)新方法進(jìn)行驗(yàn)證。

　　二、結(jié)合疫苗的臨床研究

　　為評(píng)價(jià)結(jié)合疫苗的安全性和免疫原性，應(yīng)按國(guó)家規(guī)定的要求進(jìn)行結(jié)合疫苗的臨床研究。由于結(jié)合疫苗（尤其是多價(jià)結(jié)合疫苗）生產(chǎn)工藝相對(duì)復(fù)雜，影響因素較多，出現(xiàn)批間差異的可能性相對(duì)較大。因此，多價(jià)結(jié)合疫苗宜采用多批疫苗進(jìn)行臨床研究。如果生產(chǎn)工藝發(fā)生重大改變，或是將多價(jià)疫苗作為一種新聯(lián)合疫苗的組分時(shí)，應(yīng)考慮重新進(jìn)行臨床研究。

　　如果結(jié)合疫苗的生產(chǎn)工藝或劑量、劑型發(fā)生了變化，應(yīng)及時(shí)向國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局報(bào)告，由國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局根據(jù)具體情況組織專(zhuān)家進(jìn)行再評(píng)估，評(píng)估的內(nèi)容包括：發(fā)生的變化是否會(huì)影響結(jié)合疫苗的質(zhì)量、批間一致性、結(jié)構(gòu)完整性和免疫原性。應(yīng)考慮到多個(gè)細(xì)微改變可能產(chǎn)生的累積效應(yīng)。

　　必要時(shí)，結(jié)合疫苗的臨床研究中可設(shè)置多糖疫苗對(duì)照組。如果偶聯(lián)疫苗的適應(yīng)證包括載體蛋白來(lái)源細(xì)菌所導(dǎo)致的疾病，可設(shè)置載體菌疫苗對(duì)照組。

　　應(yīng)采用適宜的血清學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估結(jié)合疫苗的免疫保護(hù)效果，應(yīng)對(duì)測(cè)定IgG抗體所采用的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，從而驗(yàn)證其功能抗體與IgG抗體的相關(guān)性，此外，還可通過(guò)臨床研究，證明結(jié)合疫苗能誘導(dǎo)多糖疫苗無(wú)法誘導(dǎo)的免疫記憶反應(yīng)。