真菌檢驗技術的進步：

真菌檢驗的臨床重要性日益增加。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)和鑒定技術需時較長，且深圳特區(qū)部真菌感染的病原菌常不易培養(yǎng)成功，成為實驗診斷的難點。

近年來，真菌感染的快速實驗診斷技術正在努力解決這一問題。

一、應用分子生物學技術自臨床標本中檢出真菌DNA；

二、應用單抗和學技術自臨床標本中快速檢出真菌抗原；

三、利用真菌的特異性酶快速診斷真菌；

四、常規(guī)培養(yǎng)與鑒定技術的進步，現(xiàn)分述如下。

一、常規(guī)分離、鑒定技術的進步

利用酵母樣真菌在生長過程中形成的酶，作用于培養(yǎng)基中的色原底物，使菌落呈現(xiàn)不同的顏色，此種CHROMOAGAR的應用，利于快速分離與初步鑒定酵母樣真菌。

酵母菌的常用鑒定系統(tǒng)已有以AP120C為代表的手工法，以ATB32C為代表的半自動法，以AMS為代表的自動代法借助于AMS的YBC卡的反應，應用人工雙歧層次分析鑒定法可使鑒定正確率提高。

利用酵母菌生長過程中形成的予成酶作用于合成的色原底物而制成的成套微量鑒定系統(tǒng)RapIDYeastplusSystem（RYP，美國InnovativeDiagnosticSystem公司），可于4小時完成酵母菌的快速鑒定，與應用API20C的一致率達97.3%.

平滑念株菌可利用其快速分解菌藻糖而迅速鑒定。用4%菌藻糖的0.1μmol/L枸櫞酸緩沖液，取待鑒定菌落濃涂入液中，37℃溫育3h，以尿葡萄糖試紙檢測，如在2分鐘內顯色（陽性）即為平滑念珠菌。經與傳統(tǒng)鑒定方法比較，此法的敏感性98.8%，特異性99.1%.

都柏林念珠菌的臨床重要性在增長，其簡易可靠的鑒定試驗為該菌在42℃不能生長，且β-D葡萄苷酶為陰性。

二、自臨床標本中直接檢查抗原

深部真菌感染者血中難于培養(yǎng)出菌體，尤其是絲狀真菌菌體常粘附、纏繞于組織，血中不易出現(xiàn)。但組織中菌體可溶性抗原可吸收入血自血、尿或感染組織液中直接檢查真菌抗原為快速診斷的重要手段；雖也可檢查抗體，但難達快速診斷。

（一）、檢測念球菌屬的甘露聚糖及其抗原

1.膠乳凝集試驗（SanofiDiagnosticsPasteur公司）

取300μl血清，加100μlEDTA處理液，混勻，煮沸3min，離心10000×g10min，取上清40μl加10μlSanofi膠乳粒子，3min內出現(xiàn)凝集為陽性。

2.EIA法。以單抗包被酶標板，用雙抗體夾心法檢查血清中念球菌抗原

3.檢測血中的白色念球菌的甘露聚糖抗體。ENA法檢查中甘露聚糖對念珠菌感染的診斷敏感性40%，特異性98%，ENA法檢查甘露聚糖抗體對念珠菌感染的診斷敏感性53%，特異性94%.

4.檢查血清中D-阿拉醇或D-阿拉伯醇與L-阿拉伯醇的比值可快速診斷念珠菌病。Yeo等用基因重組的D-阿拉伯醇脫氫酶以酶熒光法定量，發(fā)現(xiàn)念珠菌感染者血清中來自菌體的D-阿拉伯醇明顯升高，用此法迅速論斷新生兒的侵襲性念珠菌病。

Mitsutake等比較了自39名深部念珠菌病患者中檢出抗原的四種方法。應用斑點印跡法檢查其烯醇化酶（Enlase）抗原的陽性率71.8%，特異性100%；應用膠乳凝集檢查熱敏性糖蛋白抗原陽性率76.9%，特異性87.5%；應用膠乳凝集檢查甘聚糖抗原陽性率75.6%，特異性100%，應用鱟試試驗檢查細胞壁組分β-Glucan的陽性率84.4%，特異性87.5%.

（二）、肺曲菌病的血清抗原檢查

1.膠乳凝集試驗（PastorexAspergillus，法國Sanofi公司）檢查血清中半乳甘露聚糖。方法如上述膠乳凝集試驗。

2.單抗ELISA法檢查血清中半乳甘露聚糖抗原（法國Sanofi公司），敏感性達1.0ng/ml.

3.DELFIA法。Eu標記的時間分辨熒光分析法（芬蘭Wallac公司試劑）敏感性達0.5ng/ml.

（三）、血清中查組織胞漿菌抗原

以此菌莢膜的69-70kd抗原制出單抗以ELISA法檢出可及時明確診斷。

（四）、尿中檢查馬尼菲青霉菌抗原

以該菌外壁的膜蛋白為抗原制出單抗，以ENA法診斷33例患者，52例健康人和248例無真菌感染的住院患者均為陰性。本法的特異性98%，敏感性97%，陽性予示值84%，陰性予示值99.7%.

（五）、新形隱球菌的抗原檢查

新形隱球菌具有莢膜多糖抗原，可以單抗致敏的膠乳凝集試驗快速檢出。其莢膜多糖的主要成分為Glucuronoxylomannan，以此抗原的單抗包被酶標板，以雙抗體夾心法檢出抗原，血清稀釋1：8為陽性。Feldmesset用此法自AIDS患者引發(fā)新形隱球菌性腦膜炎的血清中檢出抗原而及時診斷。

（六）、深部絲狀真菌感染的抗原檢查。

絲狀真菌的細胞壁成分含（1→3）β-D葡聚糖，可用鱟試劑（鱟凝固酶）檢出。以20μg/ml為界限值。文獻報告檢查41例深部絲狀真菌感染者，37例陽性，敏感率90%，特異性100%醫(yī)`學教育網搜集整理.

三、檢查真菌的特異性酶

白色念珠菌具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶和脯氨酸氨肽酶，如用適當?shù)孜餀z測，此兩酶同時陽性，即可確定。都柏林念珠菌只具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶?？巳崮钪榫咚嵝粤姿崦福瑹釒钪榫哌量┝姿崦?，平滑、副平滑念珠菌具β-D半乳糖苷酶，新形隱球菌具酚氧酶，均可用適當呈色底物快速完成鑒定。

四、分子生物學技術

（一）、用PCR等技術字標本中擴增真菌DNA.國內應用PCR與反向斑點雜交快速檢測及鑒定念珠菌主要種別。國外可以用PCR-DEIA技術從血清中擴增出白色念珠菌的DNA來診斷念珠菌病。

針對真菌的共同序列而設計的‘全能引物’（pan-primer）而擴增580bp的產物，為真菌所共有。檢測血液標本即可明確體內有無真菌感染。

（二）、用于真菌的型別分析。國內應用隨機引物PCR擴增后進行真菌分型，結果可靠。應用隨機引物擴增物多態(tài)性分析（RAPD）可以將5種曲霉菌鑒別開（煙、黃、黑、土、構巢曲霉）。國外結合PCR與酶標記探針在紙條上進行檢測（LiPA，lineprobeassay）可鑒別出主要的致病性真菌。

（三）、檢出念珠菌的基因變異快速確定念珠菌對酮康唑的耐藥性。此種耐藥性由基因的1554T突變?yōu)镃而致，應用Lightcycler，以熒光共振能量轉移和基因片段溶解溫度曲線技術測定。