【關(guān)鍵詞】  蛋白酶體抑制劑；，泛素；，肌萎縮；，失神經(jīng)

　　Preventive and therapeutic effects of proteasome inhibitor MG132 on denervated muscle atrophy of rats

　　【Abstract】 AIM： To investigate the preventive and therapeutic effects of proteasome inhibitor MG132 on the denervated muscle atrophy of rats. METHODS： Thirtysix SD were randomly divided into 3 groups， group A： 50 μL MG132 group； group B： 100 μL MG132 group； group C： control group， 12 rats in each group. Standard model of denervated gastrocnemius muscle was established in right limb of each rat. 50 and 100 μL MG132 （concentration 20 μmol/L）， 100 μL PBS were respectively given by intramuscular injection once per day to right gastrocnemius muscle of each rat of group A， B and C. Six rats of the each group were separately sacrificed after the last injection of the 1st and 4th week， and the gastrocnemius was harvested for measurement of atrophy rate of muscle， total proteins of muscle， diameter and cross section area of myocyte. RESULTS： At the 1st week postinjectively， atrophy rate of muscle， total proteins of muscle， diameter and cross section area of myocyte in group A and B were （24.5±3.5）% and （18.2±3.3）%， （9.98±0.68） mg/mL and  （10.56±0.84） mg/mL， （14.61±1.26） μm  and （14.96±1.34） μm， （790.25±12.26） μm2 and （800.28±18.98） μm2； there were significant differences from group C （P<0.05）， and also between group A and B in atrophy rate of muscle （P<0.05）。 At the 4th week postinjectively， the above indexes were （60.2±3.7）% and（52.1±4.0）%， （7.04±0.70） mg/mL and （7.96±0.68） mg/mL， （10.63±1.04） μm and （12.16±0.98） μm， （470.48±11.14） μm2 and （498.47±10.34） μm2； there were statistic differences from group  C （P<0.05）， and also between group A and B in the above indexes （P<0.05）。 CONCLUSION： Denervated muscle atrophy can be partly prevented by proteasome inhibitor MG132 in rats， and the effects rely on the dose of MG132 and the injection duration.

　　【Keywords】 proteasome inhibitor；ubiquitin；muscle atrophy；denervation

　　【摘要】 目的：探討蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)大鼠失神經(jīng)肌肉萎縮的防治作用。 方法：36只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組12只。 A組：50 μL MG132組；B組：100 μL MG132組；C組：對(duì)照組。 制作成標(biāo)準(zhǔn)的右側(cè)坐骨神經(jīng)離斷，腓腸肌失神經(jīng)支配模型。 分別在A組和B組大鼠失神經(jīng)腓腸肌局部注射濃度為20 μmol/L的蛋白酶體抑制劑MG132 50 μL和100 μL，1次/d；C組于相同部位注射100 μL PBS，1次/d. 連續(xù)注射1 wk后半數(shù)處死各組動(dòng)物，各組剩余動(dòng)物連續(xù)注射4 wk后處死，取雙側(cè)腓腸肌進(jìn)行肌肉濕重萎縮率、總蛋白含量、肌細(xì)胞直徑和橫截面積測(cè)定，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： A組和B組肌肉濕重萎縮率、總蛋白含量、肌細(xì)胞直徑和橫截面積注射1 wk時(shí)分別為（24.5±3.5）%和（18.2±3.3）%，（9.98±0.68） mg/mL和（10.56±0.84） mg/mL，（14.61±1.26） μm和（14.96±1.34） μm，（790.25±12.26） μm2和（800.28±18.98） μm2， 與C組相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；肌肉濕重萎縮率A組和B組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 注射4 wk時(shí)分別為（60.2±3.7）%和（52.1±4.0）%，（7.04±0.70） mg/mL和（7.96±0.68） mg/mL，（10.63±1.04） μm 和（12.16±0.98） μm，（470.48±11.14） μm2和（498.47±10.34） μm2，與C組相比較差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 肌肉濕重萎縮率A組和B組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論：蛋白酶體抑制劑MG132可以通過抑制肌肉降解的泛素蛋白酶體途徑延緩大鼠失神經(jīng)肌肉萎縮，并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)其作用具有劑量依賴性。

　　【關(guān)鍵詞】 蛋白酶體抑制劑；泛素；肌萎縮；失神經(jīng)

　　0.引言

　　泛素蛋白酶體通路是失神經(jīng)骨骼肌分解代謝的主要途徑，其對(duì)蛋白底物的水解作用，可以被蛋白酶體抑制劑所阻斷，從而影響細(xì)胞的生理功能［1］。 MG132是蛋白酶體抑制劑的一種，屬于醛基肽類［2］，目前對(duì)MG132的研究主要集中于其抗腫瘤和炎癥的作用與機(jī)理方面，而對(duì)其抑制失神經(jīng)肌肉萎縮過程中泛素蛋白酶體途徑相關(guān)的研究報(bào)道較少。 本實(shí)驗(yàn)中我們制造大鼠失神經(jīng)肌肉萎縮模型后，在大鼠萎縮肌肉局部注射不同劑量的蛋白酶體抑制劑MG132，旨在觀察其對(duì)大鼠失神經(jīng)肌肉萎縮的防治作用。

　　1.材料和方法

　　1.1材料

　　36只SD大鼠，雄性，體質(zhì)量190～210 g（由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；蛋白酶體抑制劑MG132凍干粉（美國(guó)Alexix公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide， DMSO） （中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，產(chǎn)品編號(hào)D5879）；磷酸緩沖液（PBS），（博士德生物工程有限公司）；Leica圖像采集系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）；Mias圖像分析系統(tǒng)， Libror Age120測(cè)量?jī)x（日本DHIMADZU公司）；U2001紫外分光光度計(jì)（HITACHI公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1動(dòng)物分組及建模

　　將大鼠隨機(jī)分成3組： 50 μL MG132組（A組），100 μL MG132組（B組）和對(duì)照組（C組），每組12只。 按照文獻(xiàn)［3］的方法制成右側(cè)坐骨神經(jīng)離斷，腓腸肌失神經(jīng)支配模型。

　　1.2.2給藥方法

　　蛋白酶體抑制劑MG132溶于DMSO，用PBS稀釋至20 μmol/L. 確定失神經(jīng)腓腸肌的位置，用微量注射器正對(duì)肌腹中央刺入皮膚，通過改變針頭方向分5個(gè)點(diǎn)行肌肉內(nèi)注射。 按照文獻(xiàn)［4］的給藥劑量， 局部多點(diǎn)注射MG132：A組50 μL，1/d，B組100 μL，1/d；C組局部多點(diǎn)注射PBS 100 μL，1/d. 連續(xù)注射1 wk后半數(shù)處死各組動(dòng)物，各組剩余動(dòng)物連續(xù)注射4 wk后處死，取雙側(cè)腓腸肌進(jìn)行觀察。

　　1.2.3骨骼肌濕重測(cè)定

　　將雙側(cè)腓腸肌自股骨內(nèi)外髁起點(diǎn)至跟骨結(jié)節(jié)止點(diǎn)完整取下，用Libror Age120測(cè)量?jī)x準(zhǔn)確稱取肌肉濕重，計(jì)算右側(cè)（失神經(jīng)支配側(cè)）較左側(cè)（神經(jīng)支配完好側(cè)）腓腸肌的萎縮率。

　　1.2.4肌肉總蛋白含量的測(cè)定

　　實(shí)驗(yàn)側(cè)腓腸肌標(biāo)本用4 ℃生理鹽水沖洗干凈，濾紙拭干，剪除表面的筋膜，取0.2 g肌肉組織，加入1 mL細(xì)胞裂解液，在冰浴下勻漿，4℃下，2000 r/ min，離心10 min，取上清用Lowry法測(cè)總蛋白含量。

　　1.2.5骨骼肌細(xì)胞直徑和橫截面積的測(cè)定

　　截取稱量后的實(shí)驗(yàn)側(cè)腓腸肌標(biāo)本的中段，用40  g/L的甲醛液固定，經(jīng)脫水處理后，石蠟包埋切片（橫切），厚度為8 μm，行HE染色。使用Leica圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，使用Mias圖像分析系統(tǒng)對(duì)同一標(biāo)本的5個(gè)不同視野進(jìn)行觀察，并測(cè)量肌細(xì)胞直徑、截面積，計(jì)算平均值。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05.

　　2.結(jié)果

　　2.1形態(tài)學(xué)表現(xiàn)光鏡下觀察結(jié)果顯示C組大鼠腓腸肌肌細(xì)胞核增多，細(xì)胞核分布于外周，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞直徑變?。籄組和B組，肌纖維排列改善，有一定的方向性，肌細(xì)胞直徑大于對(duì)照組。

　　2.2腓腸肌濕重萎縮率和肌肉總蛋白含量注射1，4 wk時(shí)， A組和B組腓腸肌濕重萎縮率和總蛋白含量與C組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；1 wk時(shí)A組和B組腓腸肌濕重萎縮率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），總蛋白含量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 注射4 wk時(shí)， A組和B組腓腸肌濕重萎縮率、 總蛋白含量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

　　2.3腓腸肌細(xì)胞直徑和截面積注射1 wk時(shí)，A組和B組肌細(xì)胞直徑和截面積較C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），A組和B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；注射4 wk時(shí)，A組和B組肌細(xì)胞直徑和截面積較C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），A組和B組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。［醫(yī)學(xué) 教育網(wǎng) 搜集整理］

　　3.討論

　　肌肉失神經(jīng)后，從組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等方面發(fā)生了一系列的變化，但其萎縮的病理機(jī)制尚未完全明了。 許多學(xué)者針對(duì)肌萎縮過程中的可能機(jī)制，采用感覺神經(jīng)植入技術(shù)、電刺激療法、神經(jīng)生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)染的基因療法、氨哮素抑制凋亡、傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥方法治療等［5］，但療效均不滿意。 由于失神經(jīng)后肌肉萎縮的機(jī)制十分復(fù)雜，針對(duì)某種單一機(jī)制的治療，均難以達(dá)到理想的效果。

　　有研究發(fā)現(xiàn)在肌肉萎縮過程中，泛素蛋白酶體途徑起著極其重要的作用，應(yīng)用抑制劑抑制該途徑，可以作為防治失神經(jīng)肌肉萎縮的一種新療法［6］。 MG132和其他類型的蛋白酶體抑制劑相比較，其作用強(qiáng)，應(yīng)用廣泛。 體外實(shí)驗(yàn)表明，蛋白酶體抑制劑MG132可以抑制失神經(jīng)所致的鼠骨骼肌蛋白高分解代謝［7］， 本實(shí)驗(yàn)中，我們通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：蛋白酶體抑制劑MG132可以延緩失神經(jīng)損傷后肌肉萎縮，并且隨時(shí)間延長(zhǎng)，延緩作用有劑量依賴性，療效與體外實(shí)驗(yàn)和臨床使用的電刺激法［8］相仿。 蛋白酶體抑制劑MG132是一種可逆型抑制劑，當(dāng)神經(jīng)長(zhǎng)入萎縮肌肉后，其抑制作用可以被清除，恢復(fù)肌肉自身正常的代謝，避免了在體內(nèi)長(zhǎng)期蓄積產(chǎn)生的副作用。 本實(shí)驗(yàn)中制作坐骨神經(jīng)離斷模型，排除了蛋白酶體抑制劑通過作用于外周神經(jīng)而延緩肌肉萎縮的潛在可能性。

　　在抑制降解率方面，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)明顯低于體外實(shí)驗(yàn)，其可能的原因是：①肌肉蛋白組成成分存在差異，在不同的肌肉中，各種蛋白可能由蛋白酶體不同活性位點(diǎn)降解，而MG132主要是抑制了糜凝乳蛋白酶活性位點(diǎn)；②各降解過程可能存在協(xié)同作用，各過程并不是單獨(dú)孤立的存在。 蛋白酶體抑制劑MG132是從肌肉分解代謝的最終途徑防治失神經(jīng)后肌萎縮，在目前沒有一種防治方法能夠完全控制肌萎縮的情況下，是否可以將其與其他防治方法聯(lián)合應(yīng)用，提高神經(jīng)長(zhǎng)入后肌肉功能的恢復(fù)，還有待進(jìn)一步的探討。

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